关键词：木聚糖降解菌；筛选；分子鉴定；木聚糖酶；酶活0 引言 纤维素类物质是一类大量存在而又可再生的重要潜在资源，半纤维素占总纤维素的15%~30%，其中主要成分是木聚糖。

与纤维素相比，半纤维素更易为微生物所降解和转化[1]。

该酶具有广泛的应用前景[2]，研究，已有不少研究者对黑曲霉、木霉(Trichoderma sp.)等真菌及短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)等细菌的木聚糖酶进行了研究。

糖，从中很容易筛选得到高效降解木聚糖的菌株。

本研究主要从宝天曼森林腐木中富集、分离、筛选出产木聚糖酶菌株，并分析它们木聚糖酶的酶活力大小，找出酶活力较高的分离菌株。

最后通过分子生物学方法测定分离菌株的26S rDNA 序列并对其进行序列相似性分析和系统发育树分析，初步鉴定出分离菌株在系统发育上的分类地位。

材料与方法样品取自实验室保存的宝天曼地区采集的腐木。

试剂溴钾酚绿、1%刚果红溶液、1 mol/L NaCl 溶液、柠檬酸缓冲液、DNS 试剂、试剂酵母基因组提取试剂盒、PCR Magic Mix2.0、NL 1、引物NL 4、TAE 缓冲液、琼脂糖凝胶、EB 试剂。

培养基[3]木聚糖1%、酵母氮基础培养基1%、氯霉素(80 μL/100 mL)； 0.5%2%、80 μL/100 mL ）； 1%、（80mL ）；0.3%、麦芽粉0.3%、蛋白胨0.5%、琼脂2%、氯霉μL/100 mL ）； 1.4 菌株筛选[4,5] 1.4.1 富集培养取7支干净小试管，向每支试管中分装入3～5 mL 富集培养基，于121 ℃高压灭菌锅中灭菌20 min 。

用镊子夹取少许实验室保存的7种森林腐木分别放入已灭菌的富集培养基中，于28 ℃温箱中富集培养2～3 d 。

1.4.2 平板分离对培养后变混浊的富集培养液按照梯度稀释法用无菌水稀释到10-5，在超净工作台中的无菌条件下，准确吸取100 μL 的10-3～10-5不同稀释倍数的菌液涂布于已灭菌的平板培养基上，于28 ℃温箱中倒置培养2～3 d 。

1.4.3 纯化菌种根据菌落形态特征的比对，找出不同形态的菌株。

在无菌条件下，挑取不同形态的单菌落在已灭菌的纯化培养基上进行扇形划线，于28 ℃温箱中倒置培养2～3 d 。

按照同样的方法划线2～3次后即可得到纯菌落。

用镊子夹取已灭菌的牙签，将纯化培养基中的纯菌落点蘸到鉴别培养基上，于28 ℃温箱中倒置培养2～3 d 。

待菌落长大后用1%刚果红进行活性染色30 min ，倾去染液，再用1 mol/L NaCl 溶液漂洗1 h ，观察菌落周围是否有透明圈出现以及透明圈的大小。

出现透明圈的菌落即为所需要的木聚糖降解菌，再选出透明圈大且明显的菌株接种到斜面培养基上于4 ℃冰箱中保存备用。

1.5 木聚糖酶活力的测定1.5.1 木糖标准曲线的制备 取烘干好的木糖0.1000 g 溶解于蒸馏水中后，100 mL ，得到1 mg/mL 的木糖溶液。

用木糖制备标准曲线的体系见表表1 制备木糖标准曲线的溶液体系（单位：mL ）编号 0 1 2 3 4 5 6 木糖标准液 蒸馏水 DNS0 2.0 1.50.2 1.8 1.50.4 1.6 1.50.6 1.4 1.50.8 1.2 1.51.0 1.0 1.51.2 0.8 1.5注：表中所用试剂为纯试剂7支带刻度的平底试管，编号为1～7，分别加入上述溶液。

于沸水浴5 min 后，立即放入冷水中冷却，加蒸馏水定容至25 mL ，用TU-1901540 nm 波长下测OD 值并制作工作曲线备用。

摇瓶培养取一环旺盛生长于斜面培养基上的菌种接种到已灭菌的种子培养基中，28 ℃、180 r/min 进行三角瓶摇床培养24 h ，取2 mL 菌液加入已灭菌的发酵培养基中28 ℃，180 r/min 摇床培养48 h 。

1.5.3 木聚糖酶粗酶液的制备取5 mL 发酵培养基菌液于已灭菌的10 mL 离心管中，在4 ℃离心机中6000 rpm 离心20 min ，转移上清至另一离心管，则为所需的粗酶液。

取各酶液1 mL 装入1.5 mL 离心管中沸水浴煮沸10 min 得到失活酶液作为空白对照。

1.5.4 木聚糖酶酶活力的测定[6]取25 mL具盖带刻度的平底试管，加入1.5 mL 1%木聚糖柠檬酸缓冲液于50 ℃水浴预热15 min，再加入0.5 mL相应酶液(对照中加入0.5 mL灭活酶液)，50 ℃水浴保温30 min(隔几分钟震荡数次)。

然后加入1.5 mL的DNS试剂，沸水浴煮沸5 min，立即放入冷水中冷却，并定容至25 mL。

………。

1.6菌株的分子鉴定1.6.1 基因组DNA的提取菌株基因组DNA用接种环从μL无菌水中，12000 rpm离心1 min组提取试剂盒中使用说明书上的流程进行各菌株基因组的提取，并将其保存于TE缓冲液中，放入4 ℃冰箱中保存备用。

将各菌株基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据条带的亮度确定基因组的稀释倍数，作为PCR扩增的模板。

………2 结果与分析2.1菌株筛选用木聚糖作为唯一碳源从实验室保存的腐木中分离能产木聚糖酶的菌种。

………2.2 基因组DNA的提取和PCR的扩增以NL1和NL4作为引物对菌株M3的26S rDNA基因组做特异性PCR 反应扩增。

将扩增的基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析得到单一条带，片段大小长度约为600 bp，扩增产物无明显非特异扩增现象，结果见图1。

图1 菌株M3 26S rDNA 电泳图注：1、DL2000marker ；2、菌株M32.3 26S rDNA 序列相似性分析测定菌株M3的26S rDNA 序列，长度为595 bp ，将获得的26S rDNA 碱基序列经DANMAN 软件处理后在GenBank 核酸序列数据库中通过BLAST 进行同源序列搜索及相关信息检索，得到菌株M3的26S rDNA 序列与其他菌种的相似性，结果见表2。

检索结果表明，菌株M3与Trichosporon 的26S rDNA 序列有较高的相似性。

……………3 讨论木聚糖作为植物半纤维素的重要组分，是自然界继纤维素之后含量第二丰富的可更新的多糖。

以往的研究中，半纤维素的再利用通常经过酸水解处理，而后再经微生物转化为生产产品。

然而，尽管酸水解速度快，但伴随有毒性化合物产生，对随后的生物转化过程有影响。

因自然界中许多微生物类群都能产生木聚糖酶，且微生物木聚糖酶水解法处理半纤维素更为安全和有效，因而大力开发经济、高效的微生物木聚糖酶具有重要意义。

以往研究的木聚糖降解菌主要集中在霉菌、放线菌等，而霉菌、放线菌等生产木聚糖酶周期相对较长，通常为4～7 d 。

少数产木聚糖酶细菌的产酶效率相对较低。

本研究以木聚糖作为唯一碳源从森林腐木中分离、筛选出6株木聚糖降解菌。

利用刚果红活性染色法对各菌株染色，根据透明圈的大小初步判定M3降解木聚糖的能力较强。

进一步对各菌株进行酶活力测定，750bp 500bp1 2图包括图形、图序、图题、图注。

图题在图下、小4号宋字、加粗，图序与图题间空一字之距；图注在图题下方、5号仿宋字，与正文左右缩进2字符；图形中应对与文中相关的信息标注。

采用小4号宋体，用“第×页结果表明菌株M3在摇床180 r/min ，28 ℃，48 h 条件下利用1%木糖的酶活力最高，酶活力为19.098 U/mL 。

M3产酶效率高，发酵周期短，仅48 h 。

通过26S rDNA 序列相似性分析得出，菌株M3与Trichosporon porosum 亲缘关系较近，其中与Trichosporon porosum 的相似性为100%，因此初步鉴定菌株M3属于Trichosporon porosum 。

用分子生物学的方法对酵母菌进行分子鉴定，是一种快速、简便和有效的方法。

利用26S rDNA 序列分析方法对酵母菌进行分离和分子鉴定，为研究酵母菌打下了基础。

参 [1] 周世宁,陆勇军,杜扬.报,1996,35(1):91-96.[2] 黄云红,等.木聚糖酶高产微生报,2002,26(3):245-248. [3] 王辰,白逢木报[4] 国春艳.的学[5] 孙丰慧,报[6] 濮智颖.酶条件及酶学性质研究[J].陕西教育学院学报[7] 陈红歌. [J].微生物学报during production by alkali tolerant Aser- fumigatus AR1[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2003,96(4): 394-406.cillus pumilus [J].Febs Letters,1984,171(2):197-201. [10] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海:上海科学技术出版社,1986:197-231.Selection and Molecular Identification ofXylan-degrading YeastGUAN Wei-weiAbstract: the rot wood gathered from the Mountain BaoTianMan. Using dye strains, six Xylan-degrading strains are selected by these strains. Six strains are cultured in the Shaker 180 r/min, 28 ℃to determine the size of xylanase activity. The result reflects that strain enzyme activity and its xylanase activity’s size is and its 26S rDNA sequense are mesured. Through the similary analysis of strain M3 26S rDNA sequences and evolution tree analysis, strain M3 are preliminaryly identified to belong to Trichosporon porosum .Key words: Xylan-degrading bactery; filter; molecular identification; xylanase enzyme; enzyme activity。