瘤胃微生物定量方法的研究进展郭同军1,2,王加启1,王建平1,霍小凯1,2,卜登攀1,魏宏阳1,周凌云1,刘开朗1(1.中国农业科学研究院北京畜牧研究所动物营养学国家重点实验室,北京 100193;2新疆农业大学,乌鲁木齐 830052)摘要:当前人们对瘤胃中微生物的认识只有10%～20%,不断改进研究技术和手段,才能大大推动瘤胃微生态领域的研究。
作者阐述了瘤胃微生物传统定量方法(滚管计数法和最大或然数法)和分子生物学定量方法,如探针杂交技术、荧光原位杂交、D GGE、定量PCR和流式细胞计量术(flow cytometry)等的应用状况及其各自的优缺点。
关键词:瘤胃微生物;滚管计数法;最大或然数法;Real2Time PCR;流式细胞计量术中图分类号:Q93.3 文献标识码:A 文章编号:167127236(2009)0420019206 反刍动物在长期的自然进化过程中获得了独特的瘤胃发酵系统。
瘤胃内有大量的微生物,目前为止,所知细菌达200种以上,活菌数为1011个/mL,原虫超过25个属,其数量为104～106个/mL,真菌含有5个属(Miron等,2001)。
由众多的细菌、真菌和原虫组成的微生态系统中,不仅每种微生物与底物的作用机理不同,各种微生物之间的关系更是复杂(冯仰廉,2004)。
传统定量方法如滚管法(Hun2 gate,1969)和最大似然法(Dehority等,1989)只能培养瘤胃微生物中的一小部分,这使得瘤胃微生物的多样性被严重低估(Amann等,1995)。
20世纪80年代,基于16S/18S rRNA/rDNA的分子生物学定量方法的兴起,可以提供微生物核酸分子方面的特征,评价不同生态系统中微生物的遗传多样性和收稿日期:2008211226作者简介:郭同军(1981-),男,甘肃人,硕士生,研究方向:瘤胃微生物工程。
通信作者:王加启(1967-),男,安徽人,研究员,博士生导师,从事反刍动物营养和牛奶质量改良研究。
E2mail:wang2jia2qi@;010*********基金项目:“十一五”国家奶业科技支撑计划(2006BAD04A14和2006BAD04A10)。
系统发育关系(Tajima等,1999),而且还能对瘤胃微生物进行计数(Sdiva等,2004),由于研究方法的不断改进,使得人们不断的发现许多新的瘤胃微生物品种(K oike等,2003;Shin等,2004)。
认识瘤胃微生物的功能、活动规律和建立准确、快速、高效的瘤胃微生物定性及定量评价方法,是瘤胃微生态研究必然的趋势。
作者主要就当前瘤胃微生物定量方法的研究进展做了详细阐述。
1 定量研究方法在瘤胃微生物研究中的应用及评价1.1 传统定量方法 采用Hungate发展起来的厌氧培养技术,以及采用模拟瘤胃环境而设计的培养基,对瘤胃微生物进行分离、纯培养、计数、形态鉴定、生理生化特性的鉴别、分类等。
瘤胃细菌与真菌的数量用显微镜直接计数,常采用滚管法计数,以及最大或然数计数法(mo st p robable number,MPN) (Dehority等,1989)。
1.1.1 稀释平板记数法 稀释平板记数法又称活菌记数法,是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一特征设计的记数方法。
瘤胃液中细菌或真菌的活菌记数常采用亨氏滚管计数法(roll2t ube tech2 nique)(Hungate,1969)。
亨氏滚管计数法可以获 Abstract:The advances on nutrient requirements,feedstuff evaluation and formulation techniques of broiler are reviewed in this paper.It showed that feeding phases decision is more scientific f rom three to four phases;nutrient requirement specifica2 tions is presenting diversified trend of development,which are referred to be combined with the broiler breeds,environment, production goal and the evaluation systems of the feedstuff itself etc;secondly,formulation optimization technology itself is rel2 ative invariable,but if the coefficients matrix of formulation model is integrated f rom the standard deviation of the nutrients of used feedstuff,it will evidently enhance the true probability for goal nutrients to reach.The third,performance prediction a2 bout broiler is improved when diets are formulated on the basis of standardized ileal amino acid digestibility.The results and thought can provide the scientific basis for developing the new generation expert system of broiler feeding and nutrition.K ey w ords:broiler;nutrient requirements;formulation technology;standardized ileal digestibility得瘤胃微生物的特定生长因素、代谢产物等信息,其优缺点如表1所示。
Hobson(1969)采用滚管法对纤维分解菌、蛋白分解菌和淀粉分解菌等计数。
Leedle等(1982)利用滚管法对饲喂后的瘤胃总细菌计数,结果发现总细菌数减少,减少的原因可能与饲喂有关,有可能是氧气浓度升高而使细菌数目减少。
杨舒黎(2007)采用滚管法研究了日粮中添加胡麻油和豆油对奶牛瘤胃纤维分解菌、蛋白分解菌、淀粉分解菌和总细菌数量变化。
1.1.2 最大或然数法 最大或然数(M PN)记数法又称稀释培养测数法,是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其它微生物类群的干扰,并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度,是目前比较常用的方法。
该法是将待测样品作一系列稀释,一直稀释到少量的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度,采用“最大或然数”理论,可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
Dehority等(1989)首次将M PN用于瘤胃细菌记数,结果发现该法与滚管法的总细菌数无差异。
Theodorou等(1990)报道了改良的M PN用于瘤胃厌氧真菌的记数,研究结果表明, M PN法记数结果与滚管法相似,但与游动孢子直接记数的结果有很大差异。
最大或然数对接种等试验技能要求较低,液体培养基制备和接种所需时间较短,可直观观察生长情况,最终p H也易于检测。
此外,M PN法对液相和固相中的真菌均能可靠记数,对产生游动孢子少的厌氧真菌的记数更适用。
M PN的缺点是不能对微生物进行分离研究。
表1 亨氏滚管法优缺点优点缺点易维持厌氧环境;滚管重新利用;不用打开盖子就能检测培养物;感染机会减少;滚管法中厌氧环境一旦建立就无需再通额外的除氧气体;同一个管能被用来进行形态鉴定和分离纯培养;不同的培养物能够在满足它们的任一需要的条件下不同的环境中生长。
从滚管中挑选菌落非常需要技巧,当分离纯菌到一个新管中时要在环境中保留一段时间,这个操作需要反复的实践练习,以便使这个时间缩短至最短。
操作麻烦,操作者需有熟练的技术;对在实验室难于培养的微生物,无法利用该法进行检测;不同微生物的最适培养基、培养条件不同而导致生长速度不同,使得记数结果与实际菌数差异较大1.2 分子生物学定量方法 传统培养方法是早期研究瘤胃微生物的最重要手段。
但由于瘤胃微生态的复杂性,微生物又都是厌氧或兼性厌氧的,计数过程中要求的条件高、难度大,再加上传统的记数方法工作量大、耗时长,对一些不可培养的微生物又无法记数等原因,瘤胃微生物的定量研究进展缓慢。
20世纪80年代以来,以小核糖体RNA16S rRNA为主的分子生物学技术的发展,用分子生物学方法研究瘤胃微生物生态克服了基于培养方法带来的局限,加快了对瘤胃微生物群落的了解。
1.2.1 基于16S rRNA的核苷酸(基因)探针杂交技术定量瘤胃微生物 点杂交和狭线杂交技术是一种分子生物学的标准技术,最早出现于1979年,是将原始样品中的总RNA或几种核酸样品分别定量固定在固相支持物(尼龙膜或纤维素膜)上,然后用特异的探针与样品杂交,通过估计样品点信号强度,与已知浓度的标准品信号强度进行比较,确定待测样品中靶序列的量;也可通过通用探针和特异探针在相同条件下分别对同一样品进行杂交后的相应信号强度比来计算特异探针所对应的靶RNA占通用探针所对应的靶RNA的百分含量。
Olsen等(1986)首先提出杂交技术研究天然微生物的数量。
Stahl等(1988)率先利用特异性16S rRNA序列的寡核苷酸探针研究了添加莫能菌素对瘤胃纤维分解菌的变化规律,开辟了瘤胃微生物分子定量研究的先河。
Forster等(1997)运用组特异探针通过狭缝杂交技术定量了瘤胃溶纤维丁酸弧菌(B.f ibrisol2 vens)。
Weimer等(1999)使用16S rRNA狭缝杂交技术研究了4种不同日粮(青贮苜蓿和青贮玉米、24%或32%的中性洗涤纤维)对瘤胃内3种主要纤维分解菌白色瘤胃球菌(R.albus)、黄色瘤胃球菌(R.f l avef aciens)和产琥珀酸丝状杆菌(F.succi no2 genes)的影响。
Michalet2Boreau等(2002)利用该技术研究了瘤胃和盲肠内纤维分解菌的差异。
尽管分子杂交法开创了瘤胃微生物分子定量的先河,并一度广泛运用;但其结果重现性差,导致试验结果不可靠。
1.2.2 荧光原位杂交(FISH)技术定量瘤胃微生物 荧光原位杂交是采用特异的荧光标记探针在未破碎的细胞内与它的互补序列完整结合,通过荧光信号检测核酸序列。