嗜热链球菌M5-5冻干保护剂配方的优化焦琳;郑晓卫;屈晓宇;申彤;杨洁【摘要】为了研究不同冻干保护剂在真空冷冻干燥过程中对嗜热链球菌M5-5菌体细胞的保护效果,采用单因素试验和正交试验,以冻干后的菌体存活率为评价指标,考察9种冻干保护剂在冷冻干燥过程中对M5-5菌体的保护效果,以期获得最优保护剂配方.结果表明,海藻糖、甘油和脱脂乳作为单一冻干保护剂时,菌体细胞存活率分别为43.85％、47.51％和40.86％,显著高于其他6种保护剂(P＜0.05);通过正交试验确定冻干保护剂的最优配方为海藻糖60 g/L、谷氨酸钠20 g/L、甘油20 g/L、脱脂乳150 g/L,此时嗜热链球菌M5-5的冻干存活率可达88.41％.扫描电镜结果显示,添加保护剂配方组菌体细胞完整,表面光滑,说明该保护剂配方能有效减少冷冻干燥过程对菌体细胞的损伤.%In order to investigate the effect of different cryoprotectants on cell viability of Streptococcus thermophilusM5-5 in the process of vacuum freeze-drying,single-factor experiments combining with orthogonal experiments were carried out to optimize protective agents formula based on the cell survival rate of S.thermophilus M5-5 after vacuum freeze-drying.Results showed that the cell survival rate of S.thermophilus M5-5 using trehalose,glycerol and skim milk as protective agents was 43.85％,47.51％,and 40.86％,respectively,higher than that using other six protective agents.The optimum protective agents formula for S.thermophilus M5-5 were determined as follows:trehalose 60 g/L,sodium glutamate 20 g/L,glycerol 20 g/L,skim milk 150 g/L,and the cell survival rate of S.thermophilus M5-5 after vacuum freeze-drying reached 88.41％.Scanning electron microscope results showed that the cell withcryoprotectant addition was intact with smooth surface,which indicated that the well-performed cryoprotectant could effectively reduce the damage on bacterial cells during vacuum freeze-drying.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)003【总页数】4页(P95-98)【关键词】嗜酸链球菌;冻干保护剂;扫描电镜【作者】焦琳;郑晓卫;屈晓宇;申彤;杨洁【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐830046;中粮营养健康研究院生物技术中心,北京102209;新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐830046【正文语种】中文【中图分类】TS202.3目前，糖类和脱脂乳是使用较广泛且保护效果明显的保护剂，但其作用机理尚不明确[14]。
就效果而言，单一的保护剂不足以保护菌体抵抗不良的冻干环境[15]，且同种保护剂对不同菌株的保护效果不尽相同，不同浓度的保护剂保护效果也存在差异。
因此，只有复配保护剂中各组分比例和浓度达到协调时，才能达到理想的保护效果。
本研究以从新疆民丰县采集的酸乳中筛选分离的嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）M5-5为试验菌株，采用单因素法筛选出保护效果显著的保护剂，采用正交试验法确定最优的保护剂的浓度和比例，并经扫描电镜验证该保护剂配方对菌体细胞的保护效果，以期最大限度地发挥保护作用，减少菌体细胞在冻干过程中的死亡和损伤，为高效冻干发酵剂的开发提供理论依据。
1.1 材料与试剂试验菌株：本试验室从新疆民丰县收集的酸奶中分离得到的一株高产胞外多糖的乳酸菌M5-5，经16S rDNA鉴定，菌株M5-5为嗜热链球菌（S.thermophilus）。
脱脂乳粉：新西兰恒天然集团；海藻糖、甘露醇、谷氨酸钠：美国Sigma公司；抗坏血酸：国药集团化学试剂有限公司；甘油、麦芽糊精、谷氨酸：北京化工厂；以上试剂均为分析纯。
MRS培养基：蛋白胨10.00 g，酵母浸粉5.00 g，牛肉膏10.00 g，葡萄糖20.00 g，磷酸氢二钾2.00 g，柠檬酸氢二铵2.00 g，无水乙酸钠5.00 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，Tween-801.00g，蒸馏水1L，pH值为6.8，121℃灭菌15min。
1.2 仪器与设备Alpha1-2LDplus型真空冷冻干燥机：德国CHRIST公司；BHC-1300IIA2型超净工作台：苏净集团安泰公司；Neofuge 23R型力康高速低温离心机：香港力康有限公司；YX280B型手提式不锈钢蒸汽消毒器：上海三申医疗器械有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）公司；GXZ型恒温培养箱：宁波江南仪器厂；HH-S型水浴锅：巩义市英峪予华仪器厂；Spectrumlab24型紫外分光光度计：上海棱光技术有限公司。
HITACHI S-3400型扫描电镜：日本日立公司。
1.3 方法1.3.1 工艺流程菌种活化→扩大培养→离心→收集菌泥→加入保护剂溶液→悬浮液的制备→预冻→真空冷冻干燥→复水→计数活菌数（CFU/mL）→计算菌体细胞存活率1.3.2 菌株M5-5生长曲线的测定将菌株M5-5在MRS固体培养基上划线，放入37℃恒温培养箱培养24 h，连续活化3次，使菌株活力达到最佳状态。
按接种量3%接种于若干个MRS液体培养基。
将其放入37℃培养。
取出0 h的培养液测OD600nm值，并记录。
此后，每隔1 h测一次OD600nm值。
以时间为横坐标，OD600nm为纵坐标绘制菌株M5-5的生长曲线，以确定菌株M5-5的对数生长末期和稳定生长前期。
1.3.3 菌悬液的制备和冷冻干燥将处于对数期末期的菌株M5-5加入离心管中，4000r/min离心20 min后在无菌操作台中迅速倾去上清液，得到细胞糊状物（即菌泥）备用。
按菌泥∶保护剂=1∶3的体积比加入灭菌保护剂，制成菌悬液备用。
各取2 mL菌悬液分装至无菌的小西林瓶中，在-80℃预冻12 h使其完全冻结，然后转移至真空冷冻干燥机内进行真空冻干12～15 h。
利用冻干后的菌体细胞存活率来比较保护剂的效果。
1.3.4 细胞存活率计算采用梯度稀释倾注平板计数法，分别计算冻干前和冻干后菌体活细胞数，对于冻干后活菌数的计算，先将冻干后的菌粉加入与冻干前等体积的无菌生理盐水复水，以MRS培养基为计数培养基，37℃培养48h后计活菌数。
菌体细胞存活率计算公式如下：1.3.5 单因素试验根据文献报道，选择9种冻干保护剂，分别为海藻糖、麦芽糊精、谷氨酸、甘油、甘露醇、谷氨酸钠、脱脂乳、抗坏血酸、MRS培养基，按菌泥∶保护剂=1∶3体积比添加冻干保护剂，以冻干后菌体细胞存活率为指标筛选出效果较好的冻干保护剂，进行下一步的试验。
1.3.6 正交试验根据单因素筛选出合适的保护剂，最终选择海藻糖、谷氨酸钠、甘油、脱脂乳为试验因素，以细胞存活率为评价指标，每个因素取3个浓度水平，进行正交试验设计L9（34），正交试验因素与水平见表1，每组试验重复3次。
1.3.7 扫描电镜观察利用扫描电镜观察嗜热链球菌M5-5冻干前细胞形态，及添加最优保护剂配方和未添加保护剂条件下冻干后的细胞形态，验证最优保护剂配方对菌体细胞的保护效果。
2.1 菌株M5-5生长曲线的测定由于菌种收获时期会影响细胞的复苏能力和代谢活性[16]。
乳酸菌在停滞期时，不具有强的繁殖能力，且耐受力和活力较差；处于对数生长期的乳酸菌繁殖能力较强，细胞代谢活性强，适合用于扩大培养时接种，但对温度比较敏感，不宜进行低温处理；在处于对数末期和稳定前期的细胞，生理结构和代谢功能都处于稳定期，菌体抗逆性强，因此收获此时的细胞作为冷冻干燥的细胞进行研究更具有代表性。
由图1可知，在0～3 h时，OD600nm值基本没有变化，说明在此期间，菌种处于停滞期；从4 h开始OD600nm值增长速率加快，菌种生长进入对数期。
到8h后OD600nm值虽仍有上升趋势，但非常缓慢，说明菌种已经逐渐进入稳定期。
故选择培养8～13 h的菌体作为冻干保护剂筛选的研究对象。
2.2 单因素试验保护剂效果可能与保护剂类型有关，渗透型的保护剂被认为是最理想的保护剂，如甘油既能透过细胞壁也能透过细胞膜，对菌体的保护效果明显。
而仅能通过细胞壁不能穿过细胞膜（如多糖等）效果次之[17]。
本试验选用9种保护剂，不同冻干保护剂下菌体细胞存活率计算结果见表2。
由表2可知，海藻糖、甘油和脱脂乳对菌体保护效果最佳，菌体细胞存活率分别为43.85%、47.51%和40.86%。
3种保护剂对菌体保护效果之间无显著性差异（P＞0.05）。
而其他6种保护剂对菌体保护效果次之（P＜0.05）。
2.3 正交试验为了使菌体细胞在冷冻干燥过程中达到最大存活率，仅使用单一的保护剂难以达到预期的保护效果，采用复配保护剂可以在冷冻过程中各自发挥作用，又能发挥协同作用，对菌体的保护效果较理想，为确定最优的保护剂配方，对海藻糖、甘油、脱脂乳和谷氨酸钠进行用量正交试验，得到用量正交试验结果见表3。
由表3可知，海藻糖、谷氨酸钠、甘油和脱脂乳4种冻干保护剂的极差分别为10.23、22.18、17.91、12.47，说明4种保护剂对细菌冻干前后存活率的影响大小依次为谷氨酸钠＞甘油＞海藻糖＞脱脂乳。