外挂架
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仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测

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仪器：化学工作站
进样器 高压泵 流动相 色谱柱 检测器

数据处理
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固定相与流动相
正相HPLC
极性:固定相 > 流动相 固定相 - 极性强 流动相(己烷, 庚烷)- 极性弱 极性物质后出峰

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（二）液-液分配色谱
流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱，是利 用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液 相为流动相，另一种是涂于载体上的固定相。
流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配 色谱法。
流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配 色谱法。

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♪ 当泵头安装有柱塞清洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这
样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要用10％异丙醇， 并将其流速调至约2－3滴/分钟使溶液流过冲洗装置。(对于二元泵 SL，如果不使用盐溶液可以不开)10％异丙醇有助于降低水的表面 张力，并有抑菌作用。不要用其它溶剂代替。
上层的空气如果应用许可，在溶剂中加人0.0001－0.001 M的叠氮化钠(不适 用于LC/MS)如果允许，可以考虑永远在水相中加入5%或以上浓度的有机 溶剂(甲醇、乙腈)。 ➢ 有时因为有气泡吸附在管壁上而造成气泡难以排出时，可以提起管线，使 吸 入一个大气泡。让大气泡把吸附在管壁上的小气泡一起带走。 ➢ 如果在purge时发现从purge阀一直有气泡流出。这时应考虑并非泵里面仍 有气泡，而是液体从一个内径较细的管路(Purge阀出口内径比较细)流入一 个内径较粗的管线(废液管的内径要粗很多)所引起。
♪ 当泵头安装有冲洗附件而不开启10％异丙醇，会使密封垫及活塞 杆的寿命减短(二元泵SL除外)，泵头如果发出“吱吱”声不影响使 用和泵的精度 如果有必要，可以改变压缩因子（compressibility） 来达到更好的效果。

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下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。 ➢ 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液 建议每天更换。 ➢ 避免溶剂瓶暴露在直射阳光下（尤其对于水、THF等）用氩气置换流动相
仪器使用完后要采用适当的溶剂冲洗等方法维护色谱柱和系统。如果使 用了缓冲盐一定先将盐要冲洗干净。
仪器长期不用时，不建议使用纯乙腈封存。因为乙腈有生成聚合物的趋 势。建议使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。
当有流路堵塞时，可以尝试将之反接后冲洗。污染的溶剂或溶剂瓶里的 藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵和系统的的性能。 这在水溶剂或磷酸盐缓冲液(pH 4 至7) 中尤其如此。

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（三）离子交换色谱
（四）离子对色谱法
（五）分子排阻色谱法

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三、HPLC结构组成
1100/1200 HPLC仪器的结构组成：
在线脱气机(G1322A,G1379A/B) 二元/四元泵(G1310A,G1311A,G1312A/B) 自动进样器(G1313A,G1329A/B,G1367A/B/C/D) 柱温箱(G1316A/B) 二极管阵列检测器(G1315A/B/C/D) 数据处理系统
♪ 操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气机30mL，对微脱气机10mL）冲洗真 空脱气机,特别是当泵关闭了一段时间后(例如，过夜)，以及在通道中使用挥发性 混合溶剂时，防止溶剂瓶内的玻璃滤头(过滤器)堵塞及长菌，当滤头表面有黑色 或黄色污染层说明发生了堵塞，应立即清洗或更换。
♪ 定期检查排液阀的过滤白头。检查方法：拧开排液阀，以水作流动相。 -对于标准脱气机(G1322A),流速5ml/min水，若压力大于10bar，则建议更换。 -对于微量脱气机(G1379A),流速2ml/min水，若压力大于5bar，则建议更换

测定对象拓展
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由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制， 因此具有更广阔的应用潜力。经过30多年的迅速 发展，高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和 色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现已成为化学 化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势 的分离分析方法之一。

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HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的，其 以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色 谱分离技术。其分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加 精细，需高压泵推动，柱效高，分析速度快。与气相色谱 不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程，其组 成、比例和pH值可灵活调节，分离模式多样。在实际操作 中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留 值和选择性，从而使不同样品得到分离。
最低波长,低于该波长后,溶剂会有很强的紫外吸收，从而影响极限的稳 定性、干扰对所分析物质的检测。

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HPLC所使用的水必须是新鲜的和经过0.45μm滤膜过滤过的。建议每天 更换新鲜的水。长期不用时，必须把使用水的管路用有机溶剂置换，防 止长霉。
效率、功能齐全的分析工具。

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高效液相色谱法的应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分 析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、 离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了 气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约 占20% ，而80% 则需用高效液相色谱来分析。HPLC因其具有分离效能高、 分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定 生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析，世界各 国己将该法收载于药典。
消除流量脉冲

并联柱塞泵
减小流量脉冲
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仪器：四元泵
四元泵
Ｍ
Ｇ
Ｇ
Ｖ
在
起 作 用
ＭＧＧＶ：比例阀 ＡＩＶ： 主动阀 ＯＢＶ： 单向阀
不是４个泵／必配真空脱气机／二元泵各控制一种溶剂

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仪器：手动进样器-六通阀/定量环

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高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、 全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高 灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验， 并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现 在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪 器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液 收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以 及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高
Load
Inject
六通阀定量环
通废液口

定量环
进柱
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仪器：自动进样器

样品盘
机械手
自动进样100样品盘/机器手/自动洗针
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色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架 柱温箱


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HPLC 系统
溶剂传输系统：心脏 样品引入系统： 样品分离系统：关键 信号检测系统： 数据处理系统：

高压泵
进样器
色谱柱
检测器
软件
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泵的基本原理
往复活塞泵(单向阀)
弹簧隔板/红宝石球
串联柱塞泵
主流
反相HPLC
极性:固定相 < 流动相 固定相 - 极性弱 流动相(甲醇, 乙腈等)- 极性强 极性小物质后出峰

与固定相 极性相近 tR长
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流动相(反相)
常用溶剂：乙腈、甲醇、水等
实际使用：甲醇-水/乙腈-水混合体系
等度洗脱：流动相比例恒定 梯度洗脱：逐步提高有机溶剂比例
• 建议：定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶（可以高温灭菌），每三个月至少 清洗一次

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泵的使用要点
♪ 将装有溶剂瓶的溶剂箱放在泵上面或较高处。当在四元泵上使用盐溶液或有机 溶剂时，建议将盐溶液接 在下面的梯度阀口上，将有机溶剂接在上面的梯度阀 口上，有机溶剂通道最好在水或盐溶液通道的正上面。建议用水定期冲洗所有 MCGV通道除去可能在阀口析出的盐结晶。

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第二节 基本原理
液相色谱根据分离机理的不同可分为：
液固吸附色谱 液液分配色谱 离子交换色谱 离子对色谱法 分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)

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（一）液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用 的不同来分离物质。
L/O/G/O
高效液相色谱知识讲解
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内容概要

HPLC概述 工作原理 结构组成 常见故障与维护 HPLC应用
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一、HPLC 简介
高效液相色谱法(HPLC)是上个世纪七十年代迅速发展起 来的一项高效、快速的分析分离技术，是现代分离测试的重 要手段。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中 的各组分经过固定相时，由于与固定相(station phase)发生作用 (吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞 留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层 析法。

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过滤器
• 检查溶剂过滤器
查看过滤器是否变色(尤其是盛放水相的溶剂瓶)–拧开脱气机出口或比例阀 入口管线，此时溶剂会因为重力流出。当脱气机或溶剂过滤头堵塞时，溶 剂会流出不畅或不流出–临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常。