1 引言美国山核桃(Carya illinoensisK·Koch)又名薄壳山核桃、长山核桃，为胡桃科山核桃属落叶乔木。
原产美国南部和墨西哥北部,树高可达20～70m,其海拔要求在800～1600m;年平均气温15～20℃,冬季平均气温1～10℃;生长季4～10月份降雨量至少5000mm,无霜期250天以上;要求土层深厚(2m以上)潮湿且排水良好,土壤的PH值为5.8～7.0的砂质土和沙壤土以及粘土。
美国山核桃壳薄,仁饱满,并具有特别香润而爽口的食味,是世界上著名的油料干果树种。
美国山核桃于1900年左右引入我国,先后在江苏的江阴、南京,浙江的杭州,福建的莆田等地栽植。
引种范围较广,北到北京,南至海南岛,但以江苏、浙江、福建和安徽等地引种较多。
美国山核桃树形高大,树姿优美,树冠开展,根系发达,少病虫害,生长速度快,是良好的行道树和庭园绿化树种。
7年生树平均胸径为16.95cm,平均冠幅为36.32㎡,10年生树平均胸径为21.67cm,平均冠幅为82.1㎡。
木材坚韧,纹理致密,不易伸缩和翘裂,可作雕刻、家具等用材。
树体寿命长,可达百年以上,盛果期持续时间长,果实采收容易,坚果耐贮藏。
坚果外壳薄而光滑美观,取仁容易,仁肥大,出仁率高达50%以上,仁香略带甜味,口感好。
果仁营养丰富,含油量高,含脂肪高,是高档的营养保健品。
美国山核桃的经济效益高，在试验基地内通过连续几年调查其产量,10年生树产量可达18～40kg,15～25年生树产量可达25～60kg,以市场价60元/kg计算,株产产值可达1080～3600元,以目前按美国山核桃丰产栽培技术规范每667㎡最少栽10株,单产值可达10800～36000元。
若大规模推广后,价格下降为20元/kg,产值也可达10000元/667㎡以上。
美国山核桃壳薄,仁饱满,并具有特别香润而爽口的食味,是世界上著名的油料干果树种。
目前,全球美国山核桃年产量为12万t,其中美国年产量为10万t,年销售量达9万t,每1t约1.7万美元,是干果中价格最高的,但仅能出口约700t。
在我国国内年产量不足10 t,现在只有在北京、上海、广东、浙江一带的大型超市里才见有上市商品,价格非常昂贵。
随着我国人民生活水平的提高,对高档果品的消费需求日益旺盛,加之美国山核桃在我国还是一种比较新颖的商品,今后相当长一段时间内,都会很受人们欢迎,非常畅销,将供不应求。
美国山核桃传统的繁殖方法以播种繁殖为主,播种繁殖的成本比较高，而且实生苗种植15年后才能正常结果,由播种至结果苗龄所需的时间漫长,给栽培者造成很大压力,从而影响了人们栽植山核桃的积极性。
而且实生繁殖不易保持其品种的优良特性。
对于嫁接扦插等无性繁殖虽然进行了多种有益的实践和探讨,但始终未能有效应用于生产。
传统的繁殖方法是采用实生繁殖，由于自然杂交，核桃种子繁殖必然发生变异，而不能保持母本优良性状，使得种性良莠不齐，造成产量低、结果晚、品质差，降低了核桃的经济价值；采用嫁接繁殖，存在繁殖系数低，速度慢，成活率不稳定，受穗条数量限制等不利因素；采用扦插繁殖方法，由于核桃体内存在有大量单宁抑制物质，扦插不易生根。
上述种种不利因素均严重制约核桃生产的迅速发展。
本实验采用组织培养的方法进行无性繁殖，旨在通过无性快繁殖的研究，建立无性快繁技术体系，大量快速培育苗木，利用于生产，促进山核桃的生产发展。
2 材料与方法2.1实验材料实验材料采取中南林业科技大学株洲校区夕阳红花圃的美国山核桃幼树。
2.2化学药品MS培养基母液：大量元素（50ml/L）、微量元素（5ml/L）、铁盐（5ml/L）、有机元素（5ml/L）、蔗糖（40g/L）和琼脂粉（10g/L）.DWK培养基母液：大量元素（50ml/L）、微量元素（5ml/L）、铁盐（5ml/L）、有机元素（5ml/L）、蔗糖（40g/L）和琼脂粉（10g/L）.75%酒精，0.1%升汞，无菌水，蒸馏水,NaOH(1mol/L), NAA（0.5mg/ml）, 2,4-D(1mg/ml),6-BA(1mg/ml).2.3实验仪器电子天平，超净工作台，自动高压灭菌锅，冰箱，恒温培养室，加热器。
2.4实验器皿和工具200ml、100ml三角瓶，培养皿，50ml、5ml量筒，5ml、2ml、1ml移液管烧杯，药匙，牛皮纸，橡皮筋，酒精灯，酒精棉，打火机，剪刀，秒表，镊子，滤纸，解剖刀，签字笔，PH试纸。
2.5实验方法2.5.1外植体材料的选取实验材料采取中南林业科技大学株洲校区夕阳红花圃的美国山核桃幼树，选取叶及茎作为外植体进行组培。
2.5.2外植体清洗与消毒本实验采用同一外植体茎段对灭菌药剂的种类、药剂浓度、处理时间以及处理程序等进行设计并设置了4组不同的灭菌措施。
首先将外植体用洗衣粉饱和溶液上清液精刷一遍,再用流动清水冲洗12 h,用滤纸吸干外植体表面水分后,采用不同方法对外植体进行灭菌处理。
美国山核桃外植体灭菌措施与程序为:第1组：70%酒精浓度浸泡30s，2%次氯酸钠10 min,0.1%升汞浸泡10 min。
第2组：70%酒精浓度浸泡30s，0.1%升汞15min.第3组：70%酒精浓度浸泡30s，0.2%升汞10min。
第4组：70%酒精浓度浸泡30s，0.2%升汞15 min,培养基中加入0.2%活性碳,前1周暗培养。
2.5.3茎、叶同一培养基的组培本实验选用不同外植体叶和茎在同一DKW培养基上进行培养观察，同时在培养基中添加1mlNAA+2ml2、4-D等激素。
2.5.4叶片不同培养基的组培本实验叶片组培所用基本培养基为DKW和MS两种培养基，PH值都为5.8，分别添加不同的激素，其激素配比组合见表1：表1叶片DWK和MS培养基激素组合(ml)Table 1 and leaves DWK MS medium hormones单位:ml、瓶生长素0.5mg/ml DKW MSNAA 1 1 1 12、4-D 2 0 2 06-BA 0 2 0 2 接种瓶数41 31 34 352.5.5茎段不同培养基的组培2.5.5.1本实验同样采用两种培养基：第一种为DKW4ml6-BA+0.5ml NAA+1g KT,为减少褐变，配置DKW+3mgVC，中途转接;第二种培养基MS+4ml6-BA+0.5mlNAA +1ml KT,同样配置MS+ 3mgVC，中途转接。
表2茎段DWK培养基和MS培养基Table 2 stems DWK medium and medium MS单位：ml、瓶生长素0.5mg/ml DKW MS6-BA 4 4NAA 0.5 0.5KT 1 1 接种瓶数37 392.5.5.2为了进一步研究组培效果，同时配置培养基DKW,同时添加4ml6-BA和0.5mlNAA以及2gKT3 结果与分析3.1灭菌措施对外植体灭菌效果的影响由表3可知经过不同的灭菌措施处理的接种材料,其灭菌效果差异明显，其中灭菌效果最好的是第4组,材料无菌率达到95%,其方法是:先将外植体用70%酒精浸30s,再将其用0.2%升汞液浸15min,无菌水冲洗10次后接种;并且在培养基中添加0.2%的活性炭,前1周进行暗培养。
其次是第2组，材料无菌率为68%，其方法是:先将外植体在70%酒精浸30 s，在0.1%升汞里浸泡15min无菌水冲洗10次后接种。
效果最差的为第1组，无菌率只有9%。
表3不同灭菌措施对美国山核桃外植体灭菌效果的影响Table 3 different sterilization measures on the United States Pecan explants effects of sterilization组别接种材料/个无污染材料/个材料无菌率/%第1组22 2 9第2组28 19 68第3组20 7 35第4组20 19 953.2 外植体同一培养基的组培本实验采用最佳的消毒方法，对不同外植体叶和茎在同一DKW培养基上进行组培，观察结果如表4：表4 叶片和茎段组培效果Table 4 leaf and stem tissue culture results外植体叶片茎段接种瓶数41 35第1天 3 0第2天12 2第3天15 5第4天 5 3第5天 1 1剩余瓶数 5 24从表4可以看出茎段的无菌为69.6%，而叶片的无菌率为12.2%，茎段的无菌率明显大于叶片的无菌率，所以选用茎段作为组培的最佳外植体；由于采用同样的消毒的方法但是无菌率相差很大，分析原因为，在切除叶片时使叶片在空气中停留的时间过长，由于要切成正方形，当切完最后一边时，其他三边很容易在这段时间感染；而茎段切口在空气中停留时间较短，所以茎段更容易操作。
3.3叶片不同培养基的组培叶片组培选用不同DKW和MS两种培养基，分别添加不同的激素，PH值都为5.8，其培养结果如表5：表5叶片培养基培养结果Table 5 leaves medium culture培养基DKW+2.4-D+NAA MS+2.4-D+NAA DKW+6-BA+NAA MS+6-BA+NAA 总数量41 34 31 35长菌 3 2 2 2第1天褐化 1 1 0 1长菌7 5 7 6第2天褐化 2 2 1 2长菌15 13 13 14第3天褐化 1 3 1 2长菌 5 4 2 3第4天褐化 1 2 3 3长菌 1 0 0 1第5天褐化 5 2 2 1 剩余数量0 0 0 0由表5中可以看出，叶片在同一培养基不同激素的培养效果不同：在DKW培养基中，添加2、4-D和NAA激素的褐化率为24.4%，而添加6-BA和NAA激素的褐化率为22.6%，相比较在DKW培养基添加6-BA和NAA激素褐化率要低；在MS 培养基中，添加2、4-D和NAA激素的褐化率为29.4%，而添加6-BA和NAA激素的褐化率为25.7%，可以看出在MS培养基上添加6-BA和NAA激素褐化率要低。
由表中可以看出叶片在添加同一种激素的不同培养基培养效果不同：在添加同一激素2、4-D和NAA的DKW培养基中褐化率为24.4%，而在MS培养基的褐化率为29.4%；在添加同一激素6-BA和NAA的DKW培养基中的褐化率为22.6%，而在MS培养基中的褐化率为25.7%；相比较而言，在DKW培养基中的褐化率要低于在MS中的褐化率。
综上所述，可以看出叶片在DKW培养基培养的效果好于在MS培养基中培养，同时添加6-BA和NAA激素的效果要比添加2.4-D和NAA激素的效果好；但是叶片的染菌率比较高，不利于实验的进行，需要更有效的降低叶片组培中的染菌率。
3.4茎段不同培养基的组培3.4.1茎段组培所用培养基为DKW和MS两种，同时添加激素6-BA和NAA并添加活性炭，PH值为5.8，并接种的第3天进行转接，减少褐变，培养效果如表6：表6茎段不同培养基培养效果Table 6 stems of different media training results培养基DKW MS 培养基数量37 40 第1天长菌0 0褐变0 0 第2天长菌0 0褐变7 0 第3天长菌0 2褐变转接培养基转接培养基第4天长菌 5 0褐变0 0 第5天长菌14 9褐变0 7 第6天长菌 1 5褐变0 9 第7天长菌 2 1褐变 3 7 第8天长菌0 0褐变0 0 第9天长菌0 0褐变0 0 第10天长菌0 0褐变 3 0 第11天长菌0 0褐变0 0 第12天长菌0 0褐变0 0 第13天长菌0 0褐变 2 0 剩余数量0 0 从表6中可以看出，茎段的长菌率明显低于叶片的长菌率，为减缓茎段培养基的褐化率，中途进行转接，从上表可以看出，MS培养基的褐化速率明显比DKW培养基的褐化速率快，不能有效的抑制褐化；同时转接后两种培养基的长菌率明显提高，对于转接的技术方法有待提高。