（二）间接法 间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
河豚毒素
苯并芘
食源性病原菌检测试剂盒
大肠杆菌检测 沙门氏菌检测 单增李斯特菌 金黄色葡萄球菌
食品其他检测： 转基因成份的检测：如转基因玉米中中的cry9e蛋白 转基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白质．
肉制品的掺假检测： 以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋A 抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种 畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在 掺假率为1%时即可检出
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质
• 3、 谌志强, 段惠莉, 王新为, 等. 大肠埃希 菌O157:H7的胶体金免疫渗滤法检测[J]. 中国公共卫生, 2005, 21(4): 705-706. • 4、 谢昭聪, 宋志强, 吕敬章, 等. 应用胶体 金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研 究[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2005, 28(3): 163-165.
斑点金免疫层析试验（一）
兔抗鼠IgG
手持端
鼠抗HCG单抗 金标鼠抗HCG单抗 尿液浸湿标志线
斑点金免疫层析试验（二）
质控线 测试线
尿样
阳性
弱阳性
阴性
无效
ICA——双抗体夹心法测抗原
ICA--- 竞争法测抗原
免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图
ICA 竟争法结果观察
阴性 阳性
无效
ICA——间接法测抗体
ICA 结果观察
阳性 阴性
无效
IFA与ICA的比较
IFA 试剂形式 试剂保存 操作步骤 观察时间 阳性反应颜色 浓度 渗滤装置及附 加试剂 4~8℃ 6个月 3~5 3 min 操作结束颜色 不变 ICA 试剂条 室温一年 1 3~20 min 颜色逐渐加深
IFA 穿流（FLOW THROUGH）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体
酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
免疫标记技术
• 酶免疫标记技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 免疫金标记技术
酶联免疫吸附试验
• 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分 别报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸 附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
ELISA在饲料安全检测中的应用
饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏 菌 ）
玻片直接凝集试验

试管法半定量试验
2.间接凝集法
先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上 ( 如 RBC, 乳胶颗粒 ) ，再与相应抗体或抗 原反应，出现凝集为阳性结果。 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试 验等。
待检样品
抗原吸附血球 或乳胶颗粒 反应凝集物
+
→
3.间接凝集抑制试验
先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知 抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。 例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断)
一、胶体金制备
胶体金（colloidal gold）的制备一般采用 还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗 坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金 溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金 原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold
solution）。
胶体金的制备及特性
胶体金粒径 （nm) 16 1%柠檬酸钠加入量 （ml)* 2.00 胶体金特性 呈色 橙色 lmax(nm) 518
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖 苷酶
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
• 2、标记方法 • 戊二醛交联法 • 过碘酸盐氧化法
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
过碘酸盐氧化法
O
NaIO4
O O
O O
O
酶-五炭糖环
+ NH2抗体
NaBH4
O
O OH N 抗体
O
O N 抗体
H2O
O
N OH
O OH 抗体
O
Schiff碱
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析 2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
第三节免疫检测技术的基本原理
• 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原 检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未 知的抗原 . • 将免疫反应与现代测试技术结合 • 超微量的检测
免疫学检测技术的优点
• 高度的灵敏性 • 高度的特异性
免疫分析技术的应用
• 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别洗涤 除去未结合 的成分
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量
24.5
41 71.5
1.50
1.00 0.70
橙红色
红色 紫色
522
525 535
*还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量
胶 体 金（Colloidal Gold） 15~60 nm
优 质 劣 质
胶体金结合物（Conjugate）
一、免疫渗滤测定(IFA)
斑点渗漏法
•
其原理与层析法相类同，中心圆点为一株 单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样 品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆 点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株 单抗，若有抗原则形成金-Ab-Ag•薄膜的红 色斑点，而边上是金-Ab-Ab2•薄膜的质控 点，是为金标二步法。
已知抗体 待检标本
＋
＋ 抗原吸附 乳胶颗粒

步骤 1 ：将已知抗体 与待检标本混匀
步骤2：加入抗原吸 附的乳胶颗断：

凝集反应
2.沉淀反应
概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出 现沉淀物称沉淀反应。
类型： ★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 ★免疫比浊法
免疫金标记技术
• 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度 的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑 褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚 集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定 性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通 过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色 （immunogold silver staining，IGSS）。
ELISA用于农药残留的检测 甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析
农药的检测：
主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素
ICA 横流（LATERAL FLOW）
• 1、 罗立新, 缪珑, 潘力, 等. 快速检测产单核 李斯特菌免疫胶体金层析法的研究[J]. 中国卫 生检验杂志, 2006, 16(2): 154-156. • 2、 赖卫华, 熊勇华, 陈高明, 等. 应用胶体金 试纸条快速检测赭曲霉毒素A的研究[J]. 食品 科学, 2005, 26(5): 204-207.
酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
酶
辣根过氧化物酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)