A. ion-exchange chromatogram of papain hydrolysate by DEAESephacel anion-exchage chromatography and the elution was performed at 1.3 ml/min of flow rate with a linear NaCl gradient

③吸附剂与流动相（样品）不发生化学 反应； ④吸附剂颗粒直径适宜，一般吸附剂的 粒径为100-200目或200-300目。 吸附剂通常应具备以下特征：对被分离 的物质具有较强的吸附能力、有较高的 吸附选择性、机械强度高、再生容易、 性能稳定、价格低廉。

5.3.2.2常用吸附剂种类
1、活性炭： 含碳原料经碳化和活化后便成为活性炭。 是一类具有吸附性能的碳基物质的总称， 具有多孔结构和很大的比表面。 活性炭性能稳定，抗腐蚀，常用于食品 工业的脱色、脱臭、净化，也用于环境 保护中的三废处理等。
C. RP-HPLC pattern on a C18 column (4.0 ×250 mm) of active fraction Ⅳ-3 eluted on the HPLC. HPLC operation was carried out with a linear CH3CN gradient (0-1.0 M) at 2.5 ml/min of a
5.3.4 吸附色谱的操作程序
吸附色谱法的操作方式有薄层色谱和柱 色谱法。 薄层色谱是将吸附剂均匀铺在玻璃上， 把待分离的样品点在薄层上，然后用合 适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量 的目的。

吸附色谱的柱色谱法是将分离样品均
匀加入到装有吸附剂填料的柱子内， 再以适当的洗脱剂洗脱以达到不同组 分的分离。具体如下：
5.3 吸附色谱(adsorption chromatography)
吸附色谱的固定相为吸附剂，吸附剂表面 的活性中心具有吸附能力。混合物被流动 相带入柱内，依据固定相对不同物质的吸 附力不同，而使混合物分离的方法，称为 吸附色谱法。
5.3.1原理： 1、吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一 组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸 附剂表面的过程。 利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德 华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢 键)的差异而实现分离 吸附剂由载体和配位体组成。

a.是非极性吸附剂，因此对非极性溶质在 水中吸附能力大于有机溶剂中的吸附能 力。 b.当（洗脱）溶剂的极性降低时，则活 性炭对非极性溶质的吸附能力随之减弱； c.从活性炭柱上洗脱被吸附物质时，溶剂 的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。

活性炭吸附色谱应用实例

芙蓉菊寡糖片段的制备 芙蓉菊在我国广东民间用其水煎液防治糖 尿病，防治效果好。而关于芙蓉菊的药用成分， 还未见任何形式的报道。 柱层析是分离寡糖最有用的方法。常用的 手段是利用选择性吸附剂，如酸性硅胶和活性 炭，前者分离寡糖衍生物，后者分离游离态寡 糖。

（3）吸附剂和流动相的选择原则



以硅胶或氧化铝为吸附剂的柱色谱分离极性较 强的物质时，一般选用活性较低的吸附剂和极 性较强的流动相，使组分能在适宜的分析时间 内被洗脱和分离。 如果被分离的物质极性较弱，则宜选用活性较 高的吸附剂和极性较弱的流动相，使组分有足 够的保留时间。 以聚酰胺为吸附剂时，通常用水溶液作流动相， 如不同配比的醇-水、丙酮-水及二甲基甲酰胺氨水等溶液。
（1）被测物质的结构、极性与吸附力 物质的结构不同，其极性也不同，在吸附 剂表面的吸附力也不同。 常见化合物的极性（吸附能力）有下列顺 序： 烷烃 <烯烃 <醚 <硝基化合物 <二甲胺 <酯 <酮 <醛 <胺 <酰胺 <醇 <酚 <羧酸

（2）流动相的极性

流动相的洗脱能力主要是由其极性决定，强 极性流动相占据吸附中心的能力强，其洗脱 能力强，使组分的k值小，保留时间短。 常用溶剂的极性（洗脱能力）的顺序大体是： 石油醚 <环己烷 <二硫化碳 <三氯乙烷 <苯 < 甲苯 <二氯甲烷 <氯仿 <乙醚 <乙酸乙酯 <丙 酮 <正丁醇 <乙醇 <甲醇 <吡啶 <酸

2、硅胶
是一种坚硬、多孔结构的固体颗粒，分子 式为SiO2.H2O, 制备时用硫酸处理硅酸钠 水溶液使之生成凝胶，经水洗、除硫酸后 干燥即为硅胶。 硅胶易吸附极性物质（水、甲醇等），而 难于吸附非极性物质。


硅胶作为吸附剂有较大的吸附容量，分 离范围广，能用于极性和非极性化合物 的分离，如有机酸、挥发油、黄酮、氨 基酸、皂甙等。
基本原理： 用离子交换树脂分离不同离子时，样品组 分离子与流动相离子在树脂上产生竞争交 换，交换能力弱的离子易被流动相洗脱。

离子的交换能力可用选择系数表示。选择 系数大的离子交换能力强，保留时间长。 离子按选择系数的大小顺序洗脱出柱。
离子交换色谱的基本概念 （1）离子交换色谱的分辨率（Rs）：峰与 峰之间的分辨率常常用于评价离子交换色谱 和其它色谱方法的结果。两峰最大值之间的 距离与两峰宽平均值间的比值。 Rs 表示的相对分离度，可以用来决定下一步 优化的必要性。 分离体系可达到的Rs 与产品的选择性、体系 的效率和容量等三个色谱过程中需要控制的 最重要的参数有关。

式中，Sa为吸附剂的表面积，Vm为流动 相的体积。吸附系数与吸附剂的活性， 组分的性质和流动相的性质有关。
2、吸附等温线

概念：在一定温度下，当吸附过程达到 平衡时，其吸附量与浓度之间的函数关 系称为吸附等温线。


吸附等温方程

蛋白质分离提纯时 适合此吸附方程。

5.3.2常用吸附剂
色谱可分为无机基质吸附色谱（多种作 用力）、疏水作用吸附色谱（疏水作 用）、共价作用吸附色谱（共价键）、 金属螯合作用吸附色谱（螯合作用）、 聚酰胺吸附色谱（氢键作用）等，这些 色谱分离方法尽管其作用机理和作用力 不同，但都可看作是可逆的吸附作用。
（1）吸附柱的选择：酸性物质分离宜用 硅胶柱，碱性物质分离选用氧化铝柱。 实验室常用色谱柱的内径与柱长之比一 般在1：15—1：20。 （2）吸附剂的使用情况: 用量 为样品量 的30-60倍，据此选用适当规格的色谱柱。 规格： 100目左右

（3）样品的加入（上样）：尽可能选用 极性小的溶剂溶解样品及其装柱。常用 的上样方法有干样上样和湿法上样。 若样品溶于开始洗脱时的有机溶剂时， 直接将样品溶于该有机溶剂中，再轻轻 注入已准备好的色谱柱上，此法为湿法 上样。


（2）容量因子：容量因子（capacity factors） 或者保留系数k是测量组分保留值的系数。 （3）柱效：柱效与区带扩散有关。 （4）选择性：选择性定义为体系分开峰的能 力，例如两峰之间的距离。 在决定分辨率的因素中，良好的选择性比柱 效更重要。



（5）容量： 离子交换剂的容量是它可交换 的反离子的定量测量值，因此特别重要。它 可以表示为总离子容量，也可称为离子交换 剂的动力学容量。总离子容量为每克干胶或 者每毫升溶胀后的凝胶所结合的带电取代基 团的数量，它可以通过酸碱滴定测量。

按照极性增强顺序，常用混合洗脱溶剂 体系如下： (己烷/苯) → (苯/乙醚) → (苯/乙酸乙酯) → (氯仿/乙醚) → (氯仿/乙酸乙酯) → (氯 仿/甲醇) → (丙酮/水) →（甲醇/水）展开

剂的洗脱能力及极性比较
5.4 离子交换色谱
5.4.1 概念与基本原理：

概念：以离子交换树脂作为固定相，通 过固定相表面带电荷的基团与样品离子 和流动相离子进行可逆交换，选择合适 的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子 交换亲合力的不同而得到分离的方法。

（4）洗脱：洗脱用溶剂的极性宜逐步增 加，跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂， 并通过巧妙调节比例以改变极性。 一般选用TLC展开时使组分阻滞因子Rf值 达到 0.2~0.3的溶剂系统。 实际多用混合有机溶剂系统进行洗脱。 分离酸性物质时，常在洗脱溶剂中加入少 量醋酸；分离碱性物质时，则在洗脱溶剂 中加入少量氨水或吡啶或二乙胺。
(0-1.0 M) Tris-HCl buffer, pH 8.0.
B. RP-HPLC was carried out with a linear CH3CN gradient (0-1.0 M) at 2.5 ml/min of a flow rate using an UV detector at 215 nm.

流动相中组分的分子Xm与吸附在吸附剂 表面的流动相分子Ya相置换，结果组分 的分子被吸附，以Xa表示。流动相分子 回到流动相之间，以Ym表示。吸附平衡 常数称为吸附系数（Ka）,可近似用浓度 商表示：

因为流动相的量很大，[Ym]n/[Ya]n近似 于常数，且吸附只发生于吸附剂表面， 所以，吸附系数可写成：

氧化铝：适宜分离植物中的碱性成分如 生物碱。
5.3.3流动相及其选择


流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分 离组分分子竞争占据吸附剂表面活性吸附中心 的过程。 强极性的流动相分子因占据极性中心的能力强， 而具有强的洗脱作用； 非极性的流动相分子竞争占据吸附活性中心的 能力弱，洗脱作用就弱。 因此，为了使样品中吸附能力稍有差异的各组 分得到分离，就必须根据样品的性质、吸附剂 的活性选择适当极性的流动相。
Ion exchange chromatography using a Diethylaminoethyl (DEAE) l-sephacel: Among the six enzymatic hydrolysates, papain hydrolysates, showing the highest hydroxyl redical scavenging activity, were selected as purification material. The 4 ml of MWCO Ⅲ (250 mg/ml) were loaded onto a DEAE-Sephacel ion exchange column (74 ×280 mm) equilibrated with 1.0 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and eluted with a linear gradient of NaCl (0-1.0 M) in the same buffer at a flow rate of 80 ml/h. Each fraction was monitored at 280 nm, collected at a volume of 3.0 ml, and desalted using dialysis membrane, then lyophilised, antioxidative activity was also investigated. In addtion, six fractions were pooled, dialysed for overnight and lyophilised for 3 days. The strongest antioxidative fraction was lyophilised, and chromatography was used as the 附 剂混合、吸附质被吸附到吸附剂表面、 料液流出、吸附质解吸回收等四个过程。 吸附柱色谱法吸附过程是样品中各组分 的分子（X）与流动相分子（Y）争夺吸 附剂表面活性中心（即为竞争吸附）的 过程。利用被分离组分在固体表面活性 吸附中心吸附能力的差别而实现分离。