据统计，在已知化合物中，能用气相色谱测量的 约占20％；能用高效液相色谱测量的达到70％～80％ 。 三、高效液相色谱法的特点 1.分离效能高 2.选择性高 3.检测灵敏度高 4.分析速度快
高效液相色谱法的分类
按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类 1.吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2.分配色谱（Partition Chromatography） 3.离子色谱（Ion Chromatography） 4.体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography
高效液相色谱方法 及应用
色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一 个重要分支，是一个具有强大生命力的分离 分析技术。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以 液体为流动相，采用高压输液系统，将具有 不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂 、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱 ，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行 检测，从而实现对试样的分析。该方法已成 为化学、医学、工业、农学、商检和法检等 学科领域中重要的分离分析技术。
高效液相色谱仪简介
1.贮液瓶 2.高压输液泵 3.进样器 4.色谱柱 5.检测器 6.记录装置
贮液罐(流动相)
一、流动相脱气 （1）吹氦脱气法 （2）加热回流法 （3）抽真空脱气法 （4）超声波脱气法 （5）在线真空脱气法
高压输液泵及梯度洗脱装置
一、高压输液泵 高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的流
(2)示差折光检测器。
示差折光检测器是根据流动相中出现组 分时，流动相折射率发生变化而设计的。
溶液的折射率等于流动相折射率与其浓度 的乘积，加上组分折射率与其浓度的乘积。
示差折光检测器为通用型检测器，凡具有 与流动相折射率不同的组分，均可检测且操 作简便，但这种检测器灵敏度不高，对温度 十分敏感，不能做梯度淋洗。
建立高效液相色谱分析方法的
一般步骤
通常在确定被分析的样品以后，要建立一种 高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：
①根据被分析样品的特性选择适用于样品 分析的一种高效液相色谱分析方法。
②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格 （柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔 径）。
③选择适当的或优化的分离操作条件，确 定流动相的组成、流速及洗脱方式。
④由获得的色谱图进行定性分析和定量分 析。
下列优良常规操作能够最大限度降 低维修费用：
使用HPLC级试剂和流动相
清洁的仪器、流动相和样品，如果必要， 进行过滤
保证溶剂的相溶性
如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防 止污染
对仪器的使用、维护和保养进行记录
高效液相色谱的应用
剂 孔性凝胶
多种不同 性能的配 位体键联 在固相基 体上
流动相
不同极性 有机溶剂
不同极性 有机溶剂 和水
不同pH值 有机溶剂
的缓冲溶 或一定pH
液
值的缓冲
溶液
不同pH值 的缓冲溶 液，可加 入改性剂
分离原理
吸附与解 吸பைடு நூலகம்
溶解与挥 发
可逆性的 离子交换
多孔凝胶 的渗透或 过滤
具有锁匙 结构络合 物的可逆 性离解
动相。 （1）注射式泵（又称注射式螺杆泵） （2）往复型泵 2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，
是输出恒定压力的泵。
二、梯度洗脱装置
1．梯度洗脱（gradient elution）又称 为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析 周期中，按一定程度不断改变流动相的 浓度配比，称为梯度洗脱。
2．梯度洗脱特点：提高柱效以及改善检 测器的灵敏度。
进样装置
液相色谱常用的进样方式有三种：直接注射 进样、停流进样和高压六通阀进样。 直接注射进样的优点是操作简便，并可获得 较高的柱效，但这种方法不能承受高压。 停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下 降的情况下，将样品直接加到柱头。这种进 样方式操作不方便，重现性差，仅在不得已 时才使用。 高压六通阀进样的优点是进样量的可变范围 大、耐高压、易于自动化，但容易造成谱峰 柱前扩宽。
） 5.键合相色谱法（bonded-phase chromatography） 6.亲和色谱（Affinity Chromatography）
按分离过程物理化学原理分类的各种液相 色谱法的比较
吸附色谱 分配色谱 离子色谱 体积排阻 亲和色谱 色谱
固定相
全多孔固 固定液载 体吸附剂 带在固相
基体上
高效微粒 具有不同 离子交换 孔径的多
二、与气相色谱法比较 气相色谱仅能测量在操作温度下可气化且不分
解的物质，而对高沸点化合物、非挥发性物质、
热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有 困难，致使其应用受到了很大的限制。
高效液相色谱法不受样品挥发度和热稳定性的限 制，适合分离生物大分子、离子型化合物、不稳定的 天然产物以及其他各种高分子化合物等。
色谱柱
多用内壁抛光的不锈钢制成，内径2～ 6mm，直形柱柱长l0～l00cm。 在需要增加柱长时，可使用死体积小的 连接管，把几根直形柱串接起来。
检测器
用于液相色谱中的检测器，应具有 灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应 快、死体积小等特点，还应该对温度和 流速的变化不敏感。
液相色谱法中有两种基本类型的检 测器：
高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装
填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。
高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
一类是选择性检测器，如紫外一可 见分光光度检测器；
另一类是通用型检测器，如示差折 光检测器。
(1)紫外一可见分光光度检测器。
是一种应用广泛，灵敏度和测量精度都 比较高约选择性检测器。
它的检测原理基于被测组分对特定波长 的紫外一可见光的选择性吸收，被测组分浓 度与吸光度的关系服从朗伯一比尔定律。
它适用于在紫外和可见区有吸收的样品。