• （3）用梅花孔做血清流行病学调查时，将标准抗原放中
心孔，周围1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6加待检 血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合的为阳性。 待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照沉淀带完 全交叉的为阴性。待检孔虽然未出现沉淀带，但两阳性孔 的沉淀带在接近待检孔时，两端均匀向内有所弯曲为弱阳 性。若仅一端有所弯曲，另一端仍为直线着，为可疑，需
D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似； E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ； F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ；
2.抗原性质分析
1表示待检Ag
2表示标准Ag
待检Ag与标准抗原完全吻合
待检Ag中含有与标准Ag相同的
Ag；还有另外的Ag与Ab相对应 待检Ag有与Ab相对应的Ag，但 与标准Ag不同 待检Ag与标准Ag性质相同；但
实验九 免疫沉淀反应实验
概念
•沉淀反应:(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下 发生结合，出现的沉淀现象。 •液相内沉淀试验：指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触，短时间可出现反应。 •凝胶内沉淀试验：指琼脂糖内扩散或凝胶内
扩散试验。
模拟图
周围孔待检血清。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡， 以免影响扩散结果。并设立阴性血清和阳性血清对照。
• 5 扩散：加样完毕后，将琼脂板放于湿盒中，保持一定的温
度，放置37℃温箱中24~48小时观察结果。
结果判定
• （1）若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原抗体复合
物，在两孔之间出现清晰度致密白色的沉淀线，为阳性反 应。若在72h仍为出现沉淀线则为阴性。
• （2）抗原特异性与沉淀线形状的关系是：如相邻两孔的抗
原完全相同，与抗体反应会出现两条沉淀线的融合。反之， 如相邻孔抗原完全不同，则出现沉淀线的交叉。两种抗原 部分相同时，出现沉淀线的部分融合。两相邻孔抗原及其
浓度相同，形成对称相融合的沉淀线。如果两相邻孔抗原
相同但浓度不同，沉淀线不对称，移向低浓度侧。
含量较低；
1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。
2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。 3.可进行任意稀释。
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。
*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
琼脂免疫扩散为例
• 琼脂免疫扩散是可溶性抗原与相应抗体在琼脂凝
• 实验材料 • 0.15mol/L pH7.2 PBS • 1.2%琼脂（PBS配制，加入０.０１％硫柳
汞防腐） • 已知浓度和未知浓度的抗原，已知抗体。 • 载玻片，打孔器，微量加样器，酒精灯， 等
操作方法
• 1 制板：用吸管吸取3.5ml加热融化的1.2%琼脂浇注于一块
清洁的载玻片上，厚度2.5~3.0mm，注意勿产生气泡。
Ag
原理示意图
Ab
1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧
染色标本图
1.检测未知抗原或抗体 2.抗原性质分析
3.抗体效价滴定
4.抗原或抗体纯度鉴定
A Ag
B
C
D
E
F
Ab
A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似；
B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab ；
胶中所呈现的一种沉淀反应。琼脂是一种含有硫 酸基的多醣体，高温时能溶于水，冷却后凝固， 形成凝胶。琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分， 其孔径大小决定于琼脂浓度。1%琼脂凝胶的孔径 约85nm，因此允许各种抗原，抗体在琼脂凝胶中 自由扩散。抗原，抗体在含有电解质的琼脂凝胶 中扩散，由近及远形成浓度梯度，当二者在比例 恰当处相遇时，即发生沉淀反应，形成肉眼可见 的白色沉淀线，此种反应称为琼脂免疫扩散，又 简称琼脂扩散或免疫扩散。
重新检查。
• 2 打孔：待琼脂凝固后用打孔器打孔Байду номын сангаас孔径和孔距依不同疫
病检疫规程而定，一般孔径3~5mm，孔间距4~7mm。孔型 多为7孔，中央1孔，周围6孔。用针头挑出孔内琼脂。
• 3 封底：将琼脂板无凝脂面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手
背感觉稍稍烫就行。
• 4 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加入已知抗原，于