产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法
注明：蓝色字体是已修改的
一、实验目的
1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法；
2、掌握测定酶活力的方法；
3、培养自行设计、实施实验的能力。

二、实验原理
1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。

待实验前取样即可。

2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。

在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。

3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。

4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。

三、实验材料
1、土壤样品
湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。

2、培养基
淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml
种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml
发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸
氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养
条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml
3、试剂
草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液
4、玻璃器皿
锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL）
10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备：
天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培
养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种
环等
四、实验步骤
1、样本采集
①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。

②取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混悬液，加入一小层玻璃珠。

在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g，NaCL0.625g,调节PH值为7.0—7.2。

在37℃摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。

在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。

3、初筛
将富集得到的菌体液静置5分钟，然后进行浓度梯度稀释到10-6，分别在10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度下各取1mL均匀涂布在淀粉培养基上，培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。

取出培养好的平皿在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。

4、划线分离
从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。

将于种子培养基上划线后，再将培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。

5、镜检
挑取一个较好的单个菌落，通过革兰氏染色制片观察，判别所选菌
落是否为芽孢杆菌。

6、纯培养
镜检确认为芽孢杆菌后，挑菌置斜面培养基（种子培养基）上进行培养。

将斜面培养基放入37℃培养箱中培养24小时。

7、发酵培养
从斜面培养基上挑选生长状况良好的菌株在无菌操作下转移到发酵培养基上进行发酵。

发酵的条件为37摄氏度，200r/min摇床培养过夜,24h.。

7、酶活测定
将发酵液8000r/min离心10min，取上清液测酶活，每个样品重复3次，最后结果取平均值。

取5mL0.5%的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10分钟，然后加适当稀释的酶液0.5mL，反应5分钟后，用5mL0.1mol/L三氯乙酸终止反应。

取0.5mL反应液与5mL碘液显色，在620nm处测光吸收值。

以0.5mL 水代替0.5mL反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照。

五、酶活力计算
酶活力根据下式计算：
酶活力（u/mL）=（R-r）*50*D
R
式中R、r分别表示对照和反应液的光吸收值，D为酶的稀释倍数。

调整D使（R-r）/R在0.2—0.7之间。

确定在40℃5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。