黄原胶发酵及提取工艺的优化研究张学欢张永奎摘要黄原胶(Xanthan Gum)是由黄单胞菌属菌分泌的酸性胞外杂多糖，因其具有良好的稳定性和流变性，因而被广泛用于多种行业。
本实验在前人研究成果的基础上，以提高黄原胶的产量为目的，通过单因素实验确定了：在30℃，180r/min的条件下摇床培养72h，初始碳源浓度为6%（蔗糖：淀粉＝1：2），接种量为6%，；提取黄原胶时，加入2%（w/w）的硅藻土，充分震荡10min后离心30min（4000r/min），加入1%（w/v）的KNO3以及3倍体积的混醇（乙醇：异丙醇=3：1）能有效的提高提取率。
在10L发酵罐中进行了小试，产胶率为3.21%。
关键词黄原胶；发酵；提取The optimal control of the xanthan gum production and extractionAbstract:Xanthan Gum(XG) is a kind of acidic extracelluar carbohydrate by Xanthomonas campestris.This polysaccharide is used in many professions due to its characteristic. In order to improve the production rate of XG, the following studies were done. At the condition of 30 and 180r/min, The℃proper concentration of the carbon source is 6%,the composition of sucrose and starch is optimum carbon source and the optimum inoculum size is 10%. For the conditions of extraction XG, adding diatomite of 2%, agitation for 10 min, centrifugalization for 30min(4000r/min), adding KNO3 of 1% and alcohol for 3 times volume(ethyl alcohol: dimethyl carbinol=3:1) could improve the extraction effectively. Finally, the study in the fermentation tank were done, the viscosity of the final fermentation broth is 9320mPa•s, the production rate is 3.21%.Keywords:Xanthan gum; Fermentation; Extraction引言黄原胶(Xanthan gum)是由野油菜黄单胞菌或其它黄单胞菌属的菌株以碳水化合物为主要原料经发酵产生的一种胞外酸性水溶性多糖[1]。
因其具有优良的理化性质[2]，从本世纪50年代后期发现以来，到60年代初就开始进行商业性生产。
本课题主要是在前人研究的基础上，以提高黄原胶的产量为目的，通过对培养基中碳源的组成，过程参数进行比较实验和控制的研i究，对黄原胶提取过程进行优化，并且通过在小型发酵罐中进行小试，为黄原胶的大规模工业生产提供参考，也为以后类似的研究打下一定基础。
1实验材料1.1细菌从龙泉驿区十陵镇菜园中采得十字花科植物油菜病变组织中筛选、诱变、驯化后得到的野油菜黄单胞菌UV。
1.2基础培养基表1 基础培养基Table1 Basic mediumMedia types medium componentsPlate medium sucrose, 20g；yeast extract, 1g；peptone, 5g；beef extract, 3g；agar, 20g；distilled water, 1000mL；pH7.0Seed medium sucrose, 20g；yeast extract, 1g；peptone, 5g；beef extract, 3g；distilledwater, 1000mL；pH7.0Fermentation sucrose, 50g；peptone, 6g；K2HPO4，5g； MgSO4・7H2O，0.3g；medium citric acid, 1g；CaCO3，3g；distilled water, 1000mL；pH7.02实验内容与方法2.1细菌生长曲线的测定在无菌条件下，将细菌从上一级培养基中接种到均匀新鲜的培养基后，由于营养成分充足，细菌会以均分裂法进行繁殖，用血球计数板测定细菌细胞浓度。
2.2发酵工艺条件对产胶率的影响实验利用单因素实验确定黄原胶发酵的最适条件如发酵时间、碳源浓度、碳源组成[5]、接种量等。
采用平行实验，在不同的实验条件下，30℃，180r/min摇瓶发酵。
黄原胶提取方法：取一定量的黄原胶发酵液稀释3倍，加入2%的硅藻土，充分震荡10min，4000r/min离心30min，烘干称重。
2.3黄原胶提取的影响因素实验从提取剂、醇用量、无机盐成分[4]、发酵液稀释倍数几个方面优化黄原胶提取条件。
2.4黄原胶发酵小试在确定培养基组成和其他参数的基础上，为了更好解决发酵过程中溶氧和参数控制的问题，在10L发酵罐中进行小试。
3实验结果与讨论3.1细菌生长曲线的测定细菌从上一级培养基中接种到均匀新鲜的培养基后，由于营养成分充足，细菌会以均分裂法进行繁殖。
由图1可看出，0-2.5h为细菌生长延迟期；2.5-15h左右为细菌对数生长期，细菌数在此阶段增加非常明显；15-29h为细菌生长稳定期，此阶段细菌数目基本保持不变；29h以后细菌进入衰亡期，随着培养时间的延长，培养液中活菌数目逐渐减少。
图1细菌生长曲线Fig.1 Bacterial growth curve3.2发酵过程中产胶率随时间的变化由图2可看出，黄原胶发酵是典型的GadenⅡ型，前期主要为细菌生长期，后期随着细菌进入稳定生长期，开始合成黄原胶。
36-60h是黄原胶产胶的高峰期，此阶段发酵液的产胶率迅速升高。
60h后，胶产量增加缓慢。
图2细菌产胶率Fig.2 The production rate of Xanthan Gum3.3发酵条件的影响3.3.1碳源浓度对产胶率的影响改变发酵培养基中的碳源蔗糖浓度，研究碳源浓度对野油菜黄单胞菌UV发酵产胶的影响[7]。
由图3可看出，当蔗糖浓度小于6%时，随着蔗糖浓度的增加，产胶率升高；当蔗糖浓度高于6%时，产胶率随蔗糖浓度的升高反而下降。
这可能是由于当碳源浓度较低时，对于细菌生长和产胶都是不足的，因而提高碳源浓度有利于细菌生长和产胶；当碳源浓度超过6%时，细菌繁殖旺盛，导致发酵液中细菌浓度过高，对发酵过程中氧的消耗增加，限制了细菌产胶过程。
所以当碳源浓度为6%时，产胶率最高。
图3培养基中碳源含量对产胶率的影响Fig.3 The effection of carbon source concentration of Xanthan Gum production3.3.2碳源组成对产胶率的影响在固定培养基中其他成分不变的基础上，保持碳源浓度为6%，改变蔗糖和淀粉含量，在30℃，180r/min 条件下发酵72h，研究碳源组成对黄原胶产胶率的影响[8]。
由图4可看出，细菌对蔗糖的利用优于淀粉。
从蔗糖和淀粉的组合可以看出，当淀粉含量在总碳量的66.7%时，产胶率最高。
由此可以得到细菌对蔗糖的利用优于淀粉，这可能是因为蔗糖是低聚糖，在发酵过程中能够更快地水解为葡萄糖，满足细菌的营养需求。
淀粉的存在可避免发酵液中葡萄糖浓度过高产生葡萄糖效应，抑制细菌生长。
图4碳源中淀粉含量对产胶率的影响Fig.4 The effection of starch concentration of Xanthan Gum production3.3.3接种量对产胶率的影响接种量与黄原胶的产胶率之间存在明显的关系，由图5可以看出，当接种量为10%左右时，发酵的产胶率最高。
图5接种量对产胶率的影响Fig.5 The effection of inoculum size of Xanthan Gum production3.4黄原胶提取的影响因素3.4.1醇种类对醇沉淀提取黄原胶的影响相对于传统的使用单一有机溶剂作为沉淀剂，本实验尝试采用不通比例的乙醇和异丙醇的混合溶剂来提取。
将异丙醇和乙醇按照不同比例分别混合，比较其提胶率，醇种类对提取的影响如图6所示。
由图6可以看出，当醇用量一定的情况下，用混醇的提取效果明显优于单独使用乙醇或者异丙醇。
提胶率随着混醇中乙醇的比例增加而增加，当乙醇：异丙醇＝3：1时，提取效果最好，继续增加乙醇含量提胶率下降。
在乙醇中加入一定量的异丙醇可以提高提胶率，经分析可能是异丙醇与乙醇混合后改变了溶剂的极性，使得有机溶剂更易降低黄原胶表面的介电常数，从而使得黄原胶更易沉淀析出。
而提胶量不高的是由于本次实验使用的是发酵中期（40h）产胶率并不高的发酵液。
图6不同比例混醇对提胶率的影响Fig.6 The effection of mixing alcohol of Xanthan Gum extraction注：乙醇含量(%)＝乙醇体积/(异丙醇体积+乙醇体积)Note: ethanol content(%)=ethanol volum/( isopropyl alcohol volum +ethanol volum)3.4.2醇用量对醇沉淀提取黄原胶的影响由图7可看出，提胶率随着醇用量的增加而提高，当醇量为发酵液体积3倍时提胶率最高，当醇量继续增加，提胶率降低。
这个结果和传统使用单一有机溶剂作为沉淀剂得到的结果不一致[3]，可能是由于加入的异丙醇，水的含量也随着醇量的增加而增加，致使黄原胶溶解增多，损失增大，降低了多糖的回收率。
图7不同醇用量对提胶率的影响Fig.7 The effection of alcohol content of Xanthan Gum extraction3.4.3无机盐对醇沉淀提取黄原胶的影响将各添加剂按等摩尔电荷加入已经预处理好的发酵液中[4]，加入混醇（乙醇：异丙醇＝3：1），离心30min（4000r/min）3对于提胶率的提高效果最为明显。
由实验结果还可得出，KCl于NaCl。
图8不同添加剂对提胶率的影响Fig.8 The effection of different additives of Xanthan Gum extraction3.4.4发酵液稀释倍数对醇沉淀提取黄原胶的影响发酵72h后，发酵液十分粘稠，如果直接进行预处理，硅藻土不能将菌体、色素及其他杂质完全吸附，而且还可能吸附部分胶体，导致损失。