植物组织石蜡切片的制备与染色观察
一．实验器具与试剂
1.器具
小培养皿、锡箔纸、尖头和平头镊子、剪刀、刀片、吸水纸、移液枪、1枪头、移液器和移液管、量筒（50，100，250，500）、废液瓶、水浴锅、酒精灯、三角瓶、真空锅、烘片箱、木筷、石蜡切片机、染色缸、载玻片、盖玻片、显微镜等2.试剂
100%酒精、100%二甲苯、100%叔丁醇、石蜡块、蒸馏水、多聚甲醛、中性树胶、甲苯胺蓝（）染色剂等
二. 实验步骤
1.溶液配制
10×溶液：
（国药或生工）75.95g
24.12H2O（国药）25.07g
24.2H2O （国药） 4.68g
充分溶解后，用（国药）调7.0，定容1000，高压灭菌25，4℃保存。

4%多聚甲醛固定液：
1×100
1 0.5
水浴加热至60-70℃，在通风橱中加入4g多聚甲醛，待溶解后冷却至4℃，加入100µl的10%的浓硫酸调节为7.0。

2.材料准备
⑴固定
取幼嫩的植物材料，将植物组织剪成合适大小的小块，立即放入一个装有新配制的4%多聚甲醛固定液的小器皿中，固定液体积视材料多少而定，一般材料少时10材料较多时可放15，小器皿置于冰上。

上面用锡箔纸盖好后扎孔。

抽真空使得材料浸没其中（反复真空和非真空状态，并保固定液不要沸腾），待材料下沉到管底。

具体操作如下：
①放置在冰上的器皿放入真空锅里，盖上锅盖，拧开盖上螺旋，拧紧侧面螺旋，打开开关当压力表上显示到0.2时可计时10分钟。

②关上锅盖螺旋，拧松侧面螺旋，外面空气会进入真空锅内，当内外压力相等时计时10分钟。

③再重复步骤①，换一次新的固定液，4℃过夜固定，但不要超过16h。

(2)漂洗
用1×缓冲液（7.0）漂洗组织块2次，每次4℃放置30。

注意容易结晶可75℃水浴加热。

(3) 脱水
在翻转下进行梯度乙醇和叔丁醇脱水：30%、40%、50%、60%、70%乙醇（此步可保存可过夜）、10%叔丁醇+20%水+70%乙醇、20%叔丁醇+10%水+70%乙醇、30%叔丁醇+70%乙醇、50%叔丁醇+50乙醇、70%叔丁醇+30%乙醇、90%叔丁醇+10%乙醇、100%叔丁醇（2次），30次。

补充：若没有叔丁醇，可替换一下步骤进行30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%、100%乙醇，然后1/4二甲苯+3/4乙醇、1/2二甲苯+1/2乙醇、3/4二甲苯+1/4乙醇、100%二甲苯(2次)，每步均30 。

(4) 浸蜡
用刀片将石蜡块切成碎末，逐步加入到上述最后一步的材料中大约是1/4的量，37℃烘箱过夜；继续加石蜡，同时放入到42℃，待石蜡不继续熔化时放入到60℃烘箱中，等待全部融化后，将叔丁醇和石蜡的混合物换成纯蜡，每天上午下午（9点）各换纯蜡一次，持续3天。

(5) 包埋
最后将材料包埋备用。

在切片前将包埋块4℃冰箱中保存，可保存至少一年。

3.组织切片
⑴切片
将包埋的材料用切片机进行组织学切片，切成8μm厚度的连续的薄片，用刀片把蜡片切成合适的长度（能放在载玻片上即可）。

⑵展片和烘片
转入42℃的水中展片2-3，用氨基载玻片将其捞出，放置于42℃过夜烘片（烘过的片子可以再放干燥剂的条件下保存数周。

⑶脱蜡
将烘过的片子浸没在100%的二甲苯脱蜡两次，每次15；
⑷复水
梯度乙醇复水：100%、95%、85%、70%、60%、30%、水两次，每步3。

⑸染色
0.05% （甲苯胺蓝）染色37℃,30 。

染色时间不要太久，中间可以拿出来看一下。

然后把片子置于一个盛水的容器中，把片子浸入再提出，不要直接用水冲，直至水变清，拿出晾干。

二甲苯：无水乙醇=1：1 10 s 。

100%二甲苯2, 2次。

滴上1—2滴中性树胶（加拿大树胶）后盖上盖玻片（不要有气泡)。

⑹镜检观察。