1960年之后，Katzir-Katchalski学派对酶的固定方法和固定化酶的理化 性质做了大量的工作，并将其成功地应用于工业生产
1969年千烟一郎也成功地将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学 拆分过程，使其反应实现了连续化
1973年千烟一郎研制成了大肠杆菌(E．coli)的固定化细胞，即所谓固定 化微生物，并将其用于连续生产L-天门冬氨酸过程。
一、固定化的酶与固定化微生物的概念
酶: 是一类由生物细胞产生的具有催化功能的生 物大分子（蛋白质），通常称作生物催化剂
固定化酶(inmobilized enzyme) 是用适当的物理、化学方法把纯化的酶
固定于一定的空间内，使其成为既保持了本 身的特性，又能在连续反应之后可以回收和 重复使用的一种制品
优 点： 酶与载体结合很牢固，使用周期长（该法目前应用较为普遍）。
缺 点： 操作较复杂、条件较剧烈、酶活力丧失较多。
根据偶联反应方式类型的不同，可将共价结合法分为：
共价结合法
重氮法 多肽法 烷化法
叠氮法 卤化氰法
缩合剂法 载体交联法
载体共价交联法
“酶网’’载体法
●重氮法
制备原理： 先将载体（带氨基的芳香族化合物R-Y-NH2）用稀盐酸和亚
酶的活性中心(催化部分)和空间结构(结合部 分)的维持是其具有催化活力的必需条件。因此， 在制备固定化酶时，要尽可能避免采用剧烈的 条件（过高的温度和盐浓度、强酸和强碱，以 及各种有机溶剂等）处理。不然，酶的催化作 用会降低，甚至丧失，或者改变酶对底物的专 一性
（二）酶的固定化方法
固定化酶制备方法，根据制备原理分类：
缺 点：酶与载体的相互作用较弱，二者之间易于分离。
(2)离子结合法
制备原理： 将酶以离子结合的方式固定到具有离子交换基团的非水溶性载 体上制成的固定化酶 。
载体类型： 常为带各种离子基团的硅胶、纤维素、交联葡聚糖和树脂等物质 。
优 点： 操作较简便、条件较温和、酶活力不易丧失。 缺 点： 酶与载体的结合力不高，且易受缓冲液类型和pH值高低的影响。
固定化微生物
是用适当的物理、化学方法把纯，又能在连续反应之后可以回 收和重复使用的一种制品
固定化酶和固定化微生物的研究历史:
1916年Nelson和Griffin发现 :有些酶虽然不溶于水，但是仍存在催化活 性现象
1953年Grubhofer和Schleith真正开始固定化酶的研究
制备固定化酶的模式图：
1．载体结合法 (1)物理吸附法
制备原理：是将酶蛋白吸附到水不溶性的惰性载体(它是以共价或非共价 键结合其他物质的一种基质)上制成固定化酶的过程。
载体类型：常为疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、 羟基磷灰石、磷酸钙凝胶以及淀粉等物质。
优 点：酶活力不易丧失，蛋白质的空间结构不发生明显变化。
常用载体:
氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素、聚乙二 醇碘乙酰纤维素和二氯-S-三嗪基纤维素等。其中二氯-S三嗪基纤维素是带正电荷的，它对中性或碱性的酶蛋白、 或作用于带负电荷底物的酶蛋白进行固定化较为有利， 用其制备的固定化酶活力较高。
●缩合剂法
制备方法： 将酶（含-COOH和-NH2）与含-NH2和-COOH 的载体（R- NH2 或 R- COOH ）在缩合剂碳化 二亚胺（R1-N=C=N-R2）或伍德沃德试剂K(N乙基-5-苯异口恶唑-3′-磺酸)作用下进行缩合反应， 制成固定化酶
R Y NH2 NaNO2 HCl R Y N2 R Y N N Epro
弱酸性环境
●多肽法
利用肽的合成原理，使酶蛋白和载体之间以肽键连 接而制成固定化酶的过程。它又分叠氮法和卤化氰法 等
◆叠 氮 法 先用羧甲基纤维素甲酯与水合肼作用形成酰肼，然后再
与亚硝酸反应得到叠氮化合物，再在低温条件下，该化 合物和酶的游离-NH2、-OH和-SH反应形成肽键，即偶联 成固定化酶
固定化微生物的特点:
固定化微生物虽然仅较适用于催化小分子物质 的转化，并伴随发生分解生成物等副反应，但它工 序简单、稳定性好、酶活力丧失少、成本低廉，以 及利用其固有的多酶系统可对有机体的代谢途径进 行研究
本章将就固定化的酶与微生物的制备方法及其 制品的性质和应用进行讨论
三、固定化酶的制备
（一）酶固定化的前提条件
◆卤化氰法 此法与第七章“亲和层析”中亲和吸附剂的制备原理相似。
先用卤化氰(常用的是溴化氰CNBr)活化纤维素、交联葡聚 糖和琼脂糖等多糖类载体，然后在偏碱性环境条件下，使 载体（基质）与酶（配体）进行偶联，即可制成固定化酶
●烷基化法
制备原理： 利用蛋白质N末端游离-NH2、Tyr 的Ph –OH 、Cys的–OH等与 含卤族功能团的非水溶性载体发生烷基化反应（由酶蛋白取 代卤族功能团）制成固定化酶
硝酸钠（相当于亚硝酸）处理生成重氮盐化合物，然后与酶 蛋白的酚基、咪唑基发生偶联反应(游离氨基也能发生十分缓 慢的反应)，制成固定化酶（形成偶氮化合物）
常用载体: 有对氨苄基纤维素、聚氨基聚苯乙烯、3-对-氨苯氧基-2-羟丙
酰纤维素、氨基酸共聚物、交联葡聚糖-氨茴香酸酯等
加入酶蛋白，低温（0~5℃）
●载体交联法
这种制备固定化酶的方法有的地方把它归到交联法。 因为它们都是通过一个中间工具“交联剂”（如戊二醛 等）将酶固定化的。载体交联法是在酶与载体之间进行 交联，使酶固定化；而交联法是在酶分子与酶分子之间 进行交联，制成网状结构的固定化酶
2、交联法
交联法是酶分子之间在双功能基团交联剂作用下， 相互交联呈网状结构的固定化酶过程。最常用的交 联剂是戊二醛，它和酶蛋白中的游离氨基形成希夫 氏(Schiff)碱，从而使酶分子之间相互交联成固定化 酶。
应用这种固定化酶反应时，溶液的pH值、离子强度、温度和底 物浓度发生变化，往往可引起酶的脱落。 。
(3)共价结合法
制备原理：是将酶的非必需基团(α-氨基，ε-氨基，α、β、γ-羧基，羟基， 咪唑基等)通过共价键或整合剂偶联于固相载体上而制成固定 化酶。
载体类型: 有硅胶、纤维素、琼脂糖和交联葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝胶 等物质。