DNA分子（重组质粒）
2〉基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子 c、终止子
位于基因的首端,是 mRNA结合位点
位于基因的末端,终 止转录
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞
它们有什么作用？
条件
• 步骤二：目的基因与运载体重组
1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现 一NA 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌 __区_和具 有调控作用的非__编__码__区组成的
三、基因工程的基本操作程序
• 四个基本步骤： 1）提取目的基因 2）目的基因与运载体结合 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和表达
• 目的基因
目的基因是人们所 需要转移或改造的基因。
如苏云金芽孢杆菌 的抗虫基因，还有植物 的抗病（抗病毒、抗细 菌）基因、种子贮藏蛋 白的基因，以及人的胰 岛素基因、干扰素基因 等。
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区 编码区下游
终止子
与RNA聚合酶结合位点
原核 细胞 的 基因 结构
编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断
①不编码蛋白质。 非编码区 ②调控遗传信息表达,上
游有启动子，下游有终止子
真核细胞的基因结构（补充内容）
非编码区
编码区上游
编码区
非编码区
编码区下游
启动子
终止子
专题1 基因工程
§1-1 DNA重组技术 的基本工具和基本操
作程序
一 基因工程的基本内容
• 主要内容 （一）基因工程的概念 （二）基因工程的基本工具 （三）基因工程的基本操作程序 （四）基因工程的应用
复习
• 基因工程的概念
基因工程又叫基因拼接技术或DNA重 组技术。该技术是在生物体外，通过对 DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”， 对生物的基因进行改造和重新组合，然后 导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基 因在受体细胞内表达，产生出人类所需要 的基因产物。
为什么要用运载体？
1、直接将目的基因连接到受体细胞的DNA 上不能表达。
2、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且 在受体细胞中能够复制和表达的载体来用 于表达。
作为运载体必须具备哪些条件
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ D ）
A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
质粒是基因工程最常用的运载体。
绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA 分子。有的一个细菌中有一个，有的一个 细菌中有多个。
• 大肠杆菌的质粒：
最常用的质粒是大 肠杆菌的质粒，其中常 含有抗药基因，如四环 素的标记基因。质粒的 存在与否对宿主细胞生 存没有决定性作用，但 复制只能在宿主细胞内 成。
原核细胞的基因结构(补充内容）
2、基因的针线——DNA连接酶
DNA连接酶可把黏性末端之间的缝 隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的 断口连接起来，这样一个重组的DNA分 子就形成了。
E.coliDNA连接酶
• 从大肠杆菌中分离得到的。只能用于粘 性末端的连接
T4DNA连接酶
• 从T4噬菌体中分离得到的。既能用于粘 性末端的连接，又能用于平末端的连接， 但是平末端的连接效率低。
供体生物细胞
取出 DNA 用限制酶剪 去多余部分
限制酶
目的基因
1、目的基因的获取
1〉目的基因主要是指_编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因___ 请举出三个以上的例子
2〉获要对抗虫基因 再进行修饰。
知识延伸——DNA分子杂交技术
该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链 DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或 化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的 同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
返回
a
DNA
变性
b
DNA杂交
复习
• 基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
普通棉花(无抗虫特性)
提取
与运载体DNA拼接
抗虫基因
棉花细胞(含抗虫基因)
导入
棉花植株(有抗虫特性)
复习
• 基因工程的关键步骤： 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来
关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接
关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ）
酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细 胞壁的通透性。
2）使含有目的基因的重组质粒进入受体 细胞。
3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而 复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很 短的时间内就能获得大量的目的基因。
1、将目的基因导入植物细胞
（如检测SARS病毒等）
附着在膜上
c
硝化纤维素
加探针
报告基因（含荧光素分子）
d
复习题
1）将目的基因导入受体细胞有哪些方 法?(试举例说明)
2）简述农杆菌转化法
基因的结构
非编码区
编码区
非编码区
原核
RNA聚合酶 结合位点
启动子
真核
外显子
终止子 内含子
练习
1）以下说法正确的是
（C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
四环素 抗性基因
(四)目的基因的检测与鉴定
①导入检测：目的基因是否导入受体细胞
检测
方法—— DNA分子杂交 分 转录检测——分子杂交 子
检
②表达检测
测
翻译检测——抗原抗体杂交 法
鉴定
抗虫鉴定 抗病鉴定 个体水平的鉴定 活性鉴定等
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因 完成了表达吗？ 不能，受体细胞必须表现出特定的性状， 才能说因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。
④利用PCR技术扩增目的基因
PCR——聚合酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片 段的核酸合成技术。通过此技术，可 获取大量的目的基因。
表 DNA连接酶 达
载
体
2、基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用
思考：作为基因工程表达载体，只需含有
目的基因就可以完成任务吗？为什么？
• 目的基因与运载体结合
• 步骤三：目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
显微注射
移植到子宫 受精卵发育 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌
微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
过程：
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细 胞吸收 DNA
• 步骤四：目的基因的检测和表达
氨苄青霉 素抗性基因
（1）用一定的_限__制__酶____切 割质粒，使其出现一个切口， 露出_______黏__性__末_。端
（2）用同__一__种__限__制__酶_切断目 的基因，使其产生相__同___ 的_黏__性__末__端_____。
（3）将切下的目的基因片段插入质粒的__切__口__ 处，再加入适量_D_N_A_连__接__酶___，形成了一个重组
（1）农杆菌 转化法
特点:
能感染双子叶植物和祼子植物,对 单子叶植物无感染能力
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上
转化过程:
Ti质粒
构建
表 达 转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物 细 胞
插入
植物细胞 表达 染色DNA
新 性 状
（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。
限制酶
限制 酶
被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
平末端
提问
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的 黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的 DNA分子了。
特点：特异性。
即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序 列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
识别序列
• 大多数限制酶的 识别序列由6个 核苷酸组成。
• 也有少数限制酶 识别序列由4、5、 或8个核苷酸组 成。
迄今为止，有300多种 微生物中分离出4000 种限制酶