N eg a tiv e C o n tro l 0 .1 5 3
A ssa y P a tien tA P a tien tB P a tien tC C o n tro l
O .0 5 5
0 .4 1 2
1 .9 9 9
0 .1 2 3
抗体效价的Elisa测定
Protein protein interaction---ELISA
抗体效价的Elisa测定
60年代初期，Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定
抗体效价的Elisa测定
实验五 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价
1.目的要求 (1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。 (2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及 酶联免疫测定仪的使用。
抗体效价的Elisa测定
2.基本原理 免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后， 作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定 Ab/Ag。 免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应 酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg
直接在细胞、亚细胞、 应用各种液相和固相免疫
超微结构及分子水平上, 分析方法，对体液中的半
对抗原抗体反应进行定 抗原、抗原或抗体进行定
性和定位研究
性和定量测定
抗体效价的Elisa测定
酶标技术
酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色， 便于检测 常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。
substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.
基板而改变颜色，当裂解酶附二抗体
抗体效价的Elisa测定
positive
negative
抗体效价的Elisa测定
P o sitiv e C o n tro l 1 .6 8 9
抗体效价的Elisa测定
戊二醛法， 过碘酸氧化法 将酶与Ab交联在一起
Ag-Ab-抗Ab-HRP
TMB+H2O2 产物（黄色，OD450)+H2O
抗体效价的Elisa测定
图一 直接型Elisa
抗体效价的Elisa测定
图二 间接型Elisa
抗体效价的Elisa测定
图三 双抗体夹心型ELISA
抗体效价的Elisa测定
抗体效价的Elisa测定
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
抗体效价的Elisa测定
免疫标记技术
抗体效价的Elisa测定
标记抗体或抗原
荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物) 发光剂
镜检观察或进行自 动化测定
荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 及不同浓度的猎物蛋白)
抗体效价的Elisa测定
抗体效价的Elisa测定
4. 操作方法
4.1 包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml， 每凹孔加100μL，加盖置4℃过夜(37 ℃ 2h)，次日倾去凹孔内液体， 用滴管取洗涤液在每孔中加3～4滴，静置3min后倾去，重复3次，将反 应板扣放在滤纸上，以除净液体。 4.2 封闭: 每孔中加入200－400μL封闭液，加盖或用封口膜封板，置 37℃恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。
Partially purified, inactivated HIV antigens
antigens pre-coated onto an ELISA plate
部分纯化，灭活病毒抗原 抗原涂到酶标板
Patient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒+，那么这个血清含有
图四 固相抗体竞争型ELISA 未知抗原量=A（1）-A（2）
抗体效价的Elisa测定
每次反应后都要反复洗涤？ 1. 保证反应的定量反应 2. 防止重叠反应，引起非特异现象。
抗体效价的Elisa测定
抗体效价的Elisa测定
HIV (human immunodeficiency virus) detection
艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板
Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结合人类抗体
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。
抗体效价的Elisa测定
1974年 Voller等 用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗 原)，再与相应的酶标记物结合 操作更方便，易重复 灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，
1. Direct elisa different epitope Coat with prey protein Incubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein ----直接酶联免疫吸附试验不同表位 外套与猎物蛋白 孵化与诱饵蛋白 原发性抗体抗诱饵蛋白
抗体效价的Elisa测定
petitive elisa same epitope
Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various
concentration prey protein(竞争同一表位。