引物
DNA聚合酶
Mullis的 构思
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合 酶 I 的Klenow片段。不耐高温。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
PCR的基本原理
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
④模板：单、双链DNA均可。 模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过 高会导致反应的非特异性增加。 ⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
温度(℃)
94℃
55℃
Hale Waihona Puke 72℃PCR循环5’ 3’
引物
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理
3.PCR基本要素
①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂
第五章 PCR技术原理
目
录
PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用

PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
thermus aquaticus
此酶具有以下特点：
①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加 新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增 长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在 1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子 (Molecule of the year)
PCR的基本原理
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
反应体系
总体积 ①缓冲液 ②dNTP（底物） ③引物 50-100 l
最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。
2.PCR反应过程：
1个PCR 循环
①94℃变性
② 50-65℃退火
20-40个 PCR循环
③72℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 活 性
80 60 40
(%)
20 40 100 50 60 70 80 90
③引物： 1μM/L
引物设计的一般原则
① 长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp。 更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 ② 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃ 。 对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。 对于 14-70 个核苷酸的引物可用 以下公式计算。 Tm=81.5+16.6（1g[K+]）+0.41（G+C）%-（675/N） N 表示引物的核苷酸数目， [K+] 表示单价离子即钾离子的浓度 ③ 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的 3’端）。 ④ G+C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间， 4 种碱基的分布应 尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3‘ 末 端的重复排列。 ⑤ 引物的 3' 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂
10mM Tris· HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
②dNTP（底物）：等摩尔浓度的 4 种 dNTP（即 dATP、
dTTP、dCTP和dGTP），
终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）， dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。
一、PCR技术的基本原理和工作方式
1、PCR技术的基本原理
在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧 单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、 低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循 环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后 PE-Cetus 公司推出了第一台 PCR 自动化热循 环仪
• 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis <<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>> 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。