一、PCR基本工作原理
Template DNA
5 5
5 Cycle 1
5
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5
Cycle 2
5
5 5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5 5 5 5 5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
（109拷贝）。
2、高度的特异性
引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效
率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
所谓特异性：只扩增引 物之间的DNA！
引物设计原则 （1）在高度保守区,与非扩增区无同源性。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。
端polyA尾与之互补。
以人工合成的随机序列六核苷酸混
合物作为引物，进行扩增。
reverse transcription
mRNA 逆转录酶 杂化双链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
RT-PCR
cDNA
9、荧光定量 PCR（real-time PCR)
通过荧光染料或荧光标记的特异性 的探针，对PCR产物进行标记跟踪,实 时在线监控反应过程，结合相应的软件 可以对结果进行分析，计算待测样品的
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ Poly(A) RNA
逆转录
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ M N TTTTTTTTTTTT 变性 5’
启动cDNA 第一链合成
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ 3‘ 5‘ T12MN 3’锚定引物 退火 寡核苷酸随机引物
.
原 理
DNA
解链 构像
4
5
1.为正常 2、4、5纯合患者 3.为杂合子
用PCR-SSCP技术发现我
第一例
LDH遗传变异病例
病例
21岁男性： LDH：75 U/L (参考范围：110-240 U/L) 其余指标均正常 在三年的调查期间，LDH活力始终 处于较低水平，在 48-85 U/L之间
经排除其它原因，如血中的抑制剂 的存在、药物的影响等可能因素外，我 们怀疑可能有遗传性的 LDH 变异。根据 计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断 定为 H 亚基变异，采用合成的 7 对引物， 分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后 用 SSCP电泳法与正常人对照，发现变异 发生在外显子 4上，由此证明该病人的长 期低酶活力是有基因变异引起的。
5’
3’GG…GG CC…CC
5’
3’GG…GG CC…CC
6、PCR固相分析法
亲和固 相介质 模 板
PCR 扩增
探 针
检测探 针信号
生物素 化引物
可用于基因芯片的制作
7、原位PCR 原位聚合酶链式反应（In Still PCR，Is－
PCR）是利用完整的细胞作为一个微小的反应
体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的
（6）3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
引物的快速设计
5’端照抄，3’端互补。
引物设计举例
GCAATATGGCGATCGAT· · · · · · · · CATACGTTACGGCATAATCCGACTA?
如何快速设计1对引物，将红色区域的 DNA片段扩增出来？
3、适用样品的广泛性
既可是DNA，也可是RNA；既可是 纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织， 也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、 培养细胞、血细胞），又可是体液（大小 便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大 分子，也可是部分降解的DNA。
各种型号的PCR仪
聚合酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆 利斯提出的一种体外DNA快 速扩增的方法，此技术获得 1993年诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis
PCR技术基础：体内DNA的复制
5’3’
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
DNA聚合酶（I II III） 引物 dNTP Mg2+
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
第一节
PCR的原理
Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize
锚定PCR首先合成第一链cDNA,然 后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚 物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内 切位点polydC)一起作PCR扩增。
PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列
对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？
cDNA 末端核酸转移酶 3’GG…GG CC…CC 锚定引物
12、巢式PCR（nest PCR）
此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级
PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此
时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产 物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异 的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产 物的特异性。
PCR-SSCP分析原理示意
PCR-SSCP过程
过 程
--------------------------primer --------------------------↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 自显影 ↓ 结果分析
在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、特异 的技术检测到这些肿瘤细胞中CEA基
因的转录本，是发现肿瘤早期转移的关
键。
10、基因的体外诱变
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到 两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩 增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。 对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低 浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形 成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列 的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20 个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进 行扩增，靶序列的产量将相应增加。
13、差异显示PCR（differential display ）
一种以逆转录PCR为基础的研究基 因表达差异的技术。
DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病
的分子遗传学研究，是目前筛选基因表
达差异最有效的方法。
差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR)
5’ T12MN(M为A、G、C， 5’ T12MN 3’ N为A、T、G、C) 锚定引物 5’ 3‘ 5’
延伸
72˚C
退火 Tm-5˚C
根据PCR反应，能否 设计一个简易PCR仪？
简易的PCR反应
94℃ 变性
55℃ 退火 PCR循环
72℃ 延伸
四、PCR技术的特点
1、高度灵敏性； 2、高度特异性； 3、样品广泛的适应性； 4、操作简单。
1、高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍； 30
轮循环后，扩增量达100万个拷贝
A.阳性对照
B.阴性对照
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
以细胞内总RNA或mRNA为材料 进行体外扩增的技术。
主要用于克隆 cDNA、合成cDNA
探针，检测RNA病毒、分析基因表达
等。
逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游 引物作为逆转录反应的引物。 以oligo(dT)作为引物， mRNA3`末
PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n
(n 为循环次数)
PCR扩增的平台效应（plateau effect）
PCR扩增的 平台效应
是不是cycles 越多越好？
二、PCR体系基本组分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
三、PCR的反应步骤
变性 95˚C
4、操作简便易行
PCR扩增，只需数小时，就可以扩 增出大量的DNA片段，可用于检测基因 组中仅含数个拷贝的模板序列。 扩增产物一般用电泳分析，不一定 要用同位素，无放射性污染、易推广。
五、几种重要的PCR衍生技术
1、不对称PCR技术； 2、反向PCR技术； 3、多重PCR技术； 4、引物标记PCR技术； 5、实时PCR技术。 …………………………..
前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内
的扩增产物。
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单
个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位
和检测病理切片中含量较少的靶序列。
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物
引物 1 2
3
4 43 2 1
电 泳
DMD：人类肌营养不良基因
A：无外显子8,12,17,19对应 条带,说明病人外显子8～19 缺失 B：病人A中未扩增外显子 带的强度为C的一半,提示为 区域缺失携带者
C：正常人DMD基因外显子 的一般扩增形式
多重PCR检测DMD基因缺失
在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份 DNA样本中多个不同序列的靶片段。