第三节 PCR引物设计
一、基本过程 PCR是在试管内有DNA模版、引物和四种脱氧核糖核苷 酸存在条件下，由DNA聚合酶催化的DNA合成反应。 基本反应过程分为三步： 1、变性 变性是指通过加热使DNA双链间的氢键断裂， 形成两条单链的过程。加热到92~95℃可使一切复杂 的DNA都达到变性的目的。 2、退火 退火是指在温度降低的过程中，DNA的复性 过程，即变性后的两条单链在碱基互补基础上形成氢 键，结合成双链。



3、延伸 从引物的3´一端开始，沿DNA模版，由DNA聚合 酶催化的DNA新链的合成反应。 上述三步反应构成一个循环。在下一个循环中，前一 循环的产物再变性为两条单链作为模版，这样往复循 环，即可使靶序列大大扩增。
二、PCR的引物



1、引物长度 以15~30个碱基为宜。过短会影响 到扩增的特异性。 若扩增产物≤500碱基，引物长度为16~18碱基即 可。若扩增4~5kb的大片段，引物最好不要少于 24个碱基。 2、引物二聚体及二级结构 尽量避免在引物分子之间或引物分子内部有过多 的互补碱基。 如果很难完全避免引物分子内二级结构，也要尽 可能地避免在引物3´一端出现二级结构。3´一端 有二级结构的引物不能有效引发延伸。


GT-AG法则：几乎在所有高等真核生物基 因中每个内含子5´端起始的两个碱基都是 GT，3´端最后两个碱基总是AG。 目前最好并最流行的软件是GRAIL （Gene Recognition Analysis Internet Link）套装软 件/Grail-1.3/ 。
3、其他人工序列的分析与去除 测序克隆中往往也含有来自于宿主菌核酸序列的污染， 或者目的克隆的确来自于该宿主菌。这两种情况均可 通过BlastN软件直接对GenBank或EMBL数据库进行 相似性分析进行判断。显然任何与大肠杆菌和酿酒酵 母的序列具有高度一致性的序列必须慎重对待。 一些生物如大肠杆菌含有可移动的遗传物质如插入序 列。在进行克隆构建以便测序的过程中，这些序列有 时会插入到所构建的克隆，导致目的序列测序的干扰。 BlastN程序可以很方便地鉴定此类结果。如果是这样 的话，此类序列则值得怀疑。
引物设计 同源性分析
DNA基元 (motif)查找
八、基因组序列中的编码区/内含子 结构分析
真核基因外显子-内含子连接区 外显子-内含子连接区就是指外显子和内含子 的交界，又称边界序列。 重要特征： （1）内含子的两端序列之间没有广泛的同 源性，不能互补。不能通过形成发卡式二级 结构。 （2）外显子-内含子连接区序列很短，但高 度保守。

五、cDNA对应的基因组序列分析

EST和cDNA的基因组序列查询对于了解该基因组 结构包括extron/intron结构、转录调控区域以及何 种转录因子对该基因的表达进行调控等均十分重要。 同时，如果对所获得cDNA不能完全确定的情况下， 也可参考基因组的序列进行校正。在人类基因组计 划推动下，NCBI、EMBL、和Sanger Centre均提 供了基因组序列的同源性分析途径。

同时，很多实验室采用差异显示PCR（different display PCR,DD-PCR）、代表性差异分析 （representational difference analysis,RDA）等技 术发现了大量具有潜在应用价值的新基因片段，也 同时面临着全长cDNA序列难以获得的全长cDNA序列，均需要投 入较大的精力。
如:①在5´一端引入酶切位点。
②点突变。 ③计简并引物。




6、引物的Tm值(解链温度) 在允许范围内，选择较高的温度，可大大减少引 物和模版之间非特异性结合，从而提高PCR的特 异性。 引物容易复性到模版上的温度是Tm值减去 15~25℃，但为了提高PCR的特异性，在实际应 用中常常将退火温度设定为Tm值减去5~15℃。 在实验之初，宁可选用较低的退火温度，首先得 到有PCR合成产物之后再逐步提高退火温度，以 提高反应的特异性。 两条引物的Tm尽可能相等或接近，最好相差不超 过3℃。
4、存在的不足 无法直接通过此种方法获得多种剪切形式之间的差异， 真正的cDNA序列还需通过对延伸后的序列设计全长 引物，经过反转录PCR（RT-PCR）即可证实是否对 原序列的有效延伸。
三、基因的电子表达谱分析


GenBank/EMBL等数据库在其EST数据库中 积累了大量序列的基因表达信息。 电子表达谱分析原理是： 将待分析序列与EST数据库进行序列对库检 索，获得与待分析核酸序列具有高同源性的 EST序列的UniGene编号后，就可通过参与 形成UniGene Cluster的序列的组织/细胞来源 来间接地反映分析序列在何种组织中表达体 现在字段cDNA Sources中。

而在另一方面，公共数据库如GenBank/EMBL已经 拥有了大量的表达序列标签 （/dbEST）。这些EST 序列在很多时候和研究者所感兴趣的基因序列相重 叠，可能代表了同一条 cDNA序列。因而，从生物 信息学的原理出发，基于公共数据库中的EST序列 或者较长cDNA序列对新获得的EST序列进行电子 延伸，就成为很多研究者关注的焦点。
六、基于核酸序列对齐分析的功能 预测

对库比较、多序列以及序列之间的两两比 较、同源性比较及结果的显著性评价、分 子进化树的绘制。
七、可读框架分析


原理——Kozak序列：AUG上游的第三个核苷酸， 常常是嘌呤，且多数是A；紧跟在AUG后面的核 苷酸，常常也是嘌呤，但多数情况下是G。AUG 附近的核苷酸序列中以ANNAUGN和 GNNAUGPu(T/G)的利用率最高，而没有起始功 能AUG附近的核苷酸序列则无此保守性。 /gorf/gorf.html
1、通过从NCBI查询全部基因组数据库进行序列的分析 联网至 /genome/seq/HsBlast.html可 直接对已经公布的基因组序列进行查询。 2、通过从Sanger中心查询全部基因组数据库进行序列的分 析 /cgi-bin/blast/submitblast/hgp
四、核酸序列的电子基因定位分析
对核酸序列进行电子基因定位（即基因的染色体定 位），通过所定位区带的相邻基因簇,间接地提示该 基因的功能，是核酸序列分析的一个重要方面。进 行电子基因定位策略是： 利用基因组序列定位 A、将待分析序列进行对基因组数据库的同源性检索 B、得到确定基因组序列后点击“Genome View”观察 其基因组结构 C、点击用红色标记所指示的染色体列表中选择所对应 的染色体及区域。
2、利用SequencherTM软件 美国基因编码公司（Gene Codes Corp.)所开发的 SequencherTM软件在识别载体序列方面具有很强 的功能。SequencherTM软件被多个公司用于测序 数据的分析和管理。该公司同时提供该软件的演 示版，可通过访问其网址获得 （/home.html）。

也可以利用Gene Finder软件 （/urllists/genefind. htm）进行基因组序列的内含子/外显子分析。
九、基因启动子、增强子、转录 因子结合位点分析


1、通过EBI匿名FTP获得数据库 2、联网至 /seq_tools/promoter.h tml可对基因组序列进行启动子分析。

这一方案实际上来自于最初的克隆测序过程。例如， 在对一个长为1.5kb的序列进行测序过程中，如果 每次测序只能获得500bp的有效序列，则至少需进 行4次测序，而且所有测序结果的末端必须相互重 叠，以便根据末端重叠序列将该4次测序所获得的 序列片段进行组装，才能获得全长序列。
1500kb 500kb
十、重复序列分析


1、RepBase 真核生物DNA中重复序列数据库，由Genetic Information Research Institute，GIRI维护，其网 址为：/server/RepBase/。 2、著名的RepeatMasker程序即基于此进行工作 （/RM/Repeat Masker.html )。
500kb
500kb
500kb
2、基本过程 （1）将待分析的核酸序列（称为种子序列）采用 Blast软件搜索GenBank的EST数据库，选择与种 子序列具有较高同源性的EST序列（一般要求在重 叠40个碱基范围内有95%以上有同源性）（称为匹 配序列） （2）将匹配序列和种子序列装配产生新生序列，此 过程称为片段重叠群分析（contig analysis） （3）然后再以此新生序列作为种子序列重复上述过 程，直至没有新的匹配序列入选，从而生成最后的 新生序列，作为对种子序列的延伸产物。

7、引物的内部稳定性 引物的5´端互补序列应该是相对稳定结 构，而3´端应在碱基配对的情况下尽可 能为低稳定结构。 3´端应该选用A、T少选用G、C，这种引 物有更高的引发效率，且能有效地避免假 引发。
二、引物设计




软件的引物设计功能主要体现在： 1、引物分析评价功能，以“Oligo 6”最 优秀。 2、引物的自动搜索功能。以“Primer Premier”为最强且方便使用 在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。 引物设计软件以“Premier”进行自动搜索， “Oligo”进行分析评价，如此可快速设计 出成功率很高的引物。
3、利用UniGene数据库进行电子延伸
利用blastn程序，选择数据库“EST”进行序列同源性检 索。选择同源性比分最高的一条EST序列，点击右边 的UniGene超链接，将参与形成UniGene Cluster的所 有核酸序列下载到本地，利用SequencherTM软件或者 其他的序列装配软件进行组装，形成较长的新生序列。
第四章 核酸序列分析
第一节 核酸序列的基本分析 （DNAMAN软件的应用）
一、分子质量、碱基组成、碱基分布 二、序列变换 三、限制性酶切分析