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实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系， 在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖， 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而 发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
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3．Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除，需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
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在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在 体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位 点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列 转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基 因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细 胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育 成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。 在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因 的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影 响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。
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Байду номын сангаас
loxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌 体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的 8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定 了loxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与 DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的 结合域。其序列如下：
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Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动 态、可逆的过程，可以分成三种情况： 1、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，且方 向相同，Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间 的序列； 2、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，但方 向相反，Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序 列倒位； 3、如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA 链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换 或染色体易位。
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2．Cre/loxP系统优点
Cre/loxP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用， 是由该系统的诸多优点决定的：
①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后， 可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系 统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；
②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成； ③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物
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一、条件性基因敲除的策略 ——Cre/loxP重组系统
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1．Cre/loxP系统的原理
Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现， 属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编 码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号 X03453），编码38kDa蛋白质。是一种位 点特异性重组酶，能介导两个loxP位点（序 列）之间的特异性重组，使loxP位点间的基 因序列被删除或重组。
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通过上述方法所获得的基因敲除小鼠模型，其身体的各种 组织、器官以及小鼠生存的各个时期都携带有突变基因， 相应基因的功能也发生了变化。这是一种非常经典的基因 敲除方法，该方法对阐明某些基因的功能做出了十分重要 的贡献。但是，对于某些特殊的基因，该方法往往显得无 能为力，这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内 具有至关重要的功能。当这些基因突变后，胚胎往往不能 发育至正常分娩，或者即使能够出生也会因为过于严重的 生理缺陷而过早夭亡，无法开展后续研究，或者这些基因 突变后影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代，进而 不能获得携带突变基因的纯合子动物模型。针对上述问题， 近年来出现了一种特殊的基因敲除或敲入方法，被称为条 件性基因敲除或敲入(conditional gene knock out or knock in)。这种方法是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特 定阶段敲除某一特定基因的实验技术。其优势在于克服了 经典基因敲除手段所遇到的上述问题，对于在特定的组织 细胞和(或)特定的时间研究特定基因的功能，以及更好地 建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。
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经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下： 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后 与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。