切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等，引物的5’端 最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。
PCR产物的分子克隆
克隆PCR产物的目的通常是：建立用于杂交分析的克隆化DNA的永久来源， 得到高质量的DNA序列结果，以及当PCR扩增产生复杂混合产物时用于分离 PCR目的片段。PCR产物的直接克隆可以通过对扩增片段进行合适的末端处理而 提高效率。 基本方案 产生T—A突出端 TaqDNA聚合酶往往在所有的双链DNA 3’末端再加上一个非模板来源的核苷酸 (通常为A)，使PCR片段的平端克隆往往效率不高。当只有dTTP存在时，Taq DNA聚合酶可在载体的平端加上一个T，这样就会产生一个与A配对的突出端。
dNTP:一般为50－200μmol/L
Mg2+ 模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可，但
样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以
及能与 DNA结合的蛋白质。 添加剂：DMSO（二甲基亚枫），提高扩增效率及特异性
（1） 理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n-2n 的指数方式递增，PCR反应30轮循环后，PCR扩增应达到230个拷贝，约109个拷 贝。但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素 的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达106－107个拷贝。 “平台效应”：PCR反应中，当引物－模板与DNA聚合酶达到一定比值时， DNA聚合酶催化反应趋于饱和，即PCR反应不再增加。 平台效应在PCR反应中是不可避免的，但一般在平台效应出现前，PCR产物 的数量足以满足实验的需要。 （2）PCR反应条件的优化 PCR方法操作简便，但影响因素颇多，因此需要根据不同的DNA模板，摸索最 适条件。主要从： 反应的特异性、敏感性、忠实性、扩增效率等四个方面衡量
PCR反应的结果。①循环参数
变性 退火 延伸
②PCR反应成分
（3）PCR反应引物的设计 引物的设计在整个PCR扩增中占有十分重要的地位 特异性，扩增性 ①引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样 可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性 ②引物长度：15－30nt为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。 ③引物的碱基尽可能随机发布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基
DNA 分子鉴定前景广阔
我国生药品种繁多、来源复杂，根据最新统计,药用动植物约有 12000 种左右。但由于历史、地理、人为等因素，加之研究手段的
局限性，长期以来我国生药仍处于品种混乱和质量难以保证的不
利局面，很大程度上制约了中医药的发展。而DNA 分子鉴定法， 将使生药鉴定技术得以创新，而使得中医药的发展真正走向现代
随机扩增多态性DNA，用随机短引物（人工合成的六核苷酸） 进行DNA的PCR扩增。所扩增的DNA区段是事先未知的，具有随机性
和任意性，因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的
研究。（RAPD 原理） ③ ISSR (Inter-simple sequence repeats)标记:简单序列重复 区间扩增多态性。利用基因组中常出现的SSR本身设计引物，无需
生药的分子鉴定研究
利用DNA分子遗传标记和基因组序列分析技术，从居群、分子乃 至基因水平上，准确刻划药用动植物遗传背景差异和亲缘关系，进而 构建基于叶绿体基因组和（或）和基因组基因序列分析的重要药用动 植物系统发育树，将是分子生药学基础研究的重心。
目前可用于分子系统学研究的主要基因种类有：rbcL，matK， rps4，trnT-trnF， ITS等等。以叶绿体基因组片段为主，核基因应 用较少但信息量巨大。
DNA 分子遗传标记技术已有20多种，认为五大类比较合适进行研究。
1. 以Southern 杂交为基础的DNA分子标记技术
2. 以PCR为基础的分子标记技术
3. 以重复序列为基础的分子标记技术 4. DNA序列分析
DNA 分子遗传标记技术的优点
1. DNA 分子标记不受发育时期和环境的影响，DNA分子标记 在基因水平进行标记，不受取材部位、时间和环境的影响， 而形态标记和生化标记都是基因表达的结果，其结果受发 育和环境的影响，测定有时会不准确； 2. DNA 分子标记通常是共显性，表现的信息量大，可精确鉴 定基因型组合； 3. DNA 分子标记多态性强，根据测得的大量标记位点绘制的 连锁图，其多态信息量比形态标记高得多。
分子生药学
——生物分析技术
在分子水平上研究生药的鉴定、生产和成分的一门科学， 所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法，是生药 学的一个极富前瞻性和前景性的分支。 可以说，分子生药学不仅继承传统生药学的内容和使命，更 将赋予生药学新的任务和挑战。
中国中医研究院中药研究所所长—黄璐琦
生药学中的一个分支学科
高纯度的DNA模板的制备 严格的Taq DNA聚合酶浓度和来源 合适的镁离子浓度，太高会产生弥散背景，太低了 得到的PCR产物条带淡
DNA复制原理的具体应用— PCR技术
Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 它是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、 RNA引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90℃－95℃，1－2min）,低温 退火（25℃－37℃，1－2min）,中温延伸（60℃－75℃，90 sec-5min）,这样反复 循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。（原理图） 1、PCR反应成分：Taq DNA聚合酶 引物浓度：一般0.1-0.5μmol/L
（单核苷酸多态性的DNA标记）
⑧ SNP（single nucleotide polymorphism）标记:
单核苷酸多态性。不同个体基因组DNA序列同一位置上的 单个核苷酸的差别。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同 序列长度里的单个碱基的差别。 (SNP_) ⑨ 主要类型的DNA分子标记的技术特点比较
的含量在40％－60％之间。
④引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应避免有回文结构。 ⑤二个引物不应有互补序列，特别是3’端应避免互补，以免形成“引物二聚
体”，浪费引物。
⑥引物5’末端碱基无严格限制，在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下，其 5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态，因此可在引物5’端加上限制性内
分子生药学
——生物分析技术
生药学这个学科的建立已经有近200年的历史，其间虽然也在 不断的发展，然而对生药材鉴定技术而言，最初只是药材性 状鉴别，也就是说药材的外部形态特征、色泽、断面、质地、 气味等进行药材真伪鉴别，其后逐步发展为药材细胞组织形 态特征为依据，其间还在真伪鉴别和质量研究中将理化方法 引入，特别是以成分分析为依据，将各种光谱分析法应用得 淋漓尽致，使生药学发展到一个新的高峰。
这里仅介绍遗传的分子标记中的几种重要的分子标记: 1.同工酶标记: 同工酶（Isozyme）是一类分子结构不同、 功能相似、催化同样的生化反应的酶。 同工酶标记是利用编码同工酶的等位基因与同工酶酶谱 的相关性及其共显性的特点进行染色体定位和遗传连锁分析。
2.DNA分子标记: （基于DNA-DNA杂交的DNA标记） ① RFLP标记 (restriction fragment length polymorphism)： DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的 改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致使酶切片段长度随之发生变 化。这种变化引起的多态现象即为限制性片段长度多态性（RFLP)。
对RFLP的检测主要是用Southern杂交的方法进行，即利用限制酶酶解及凝胶 电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之杂交，通 过发射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。( 图 Southern )
（基于PCR的DNA标记：随机引物PCR标记）
② RAPD（random amplified polymorphic DNA）标记：
中药高产、优质、多抗性品种的培育 濒危紧缺中药资源的保护和持续利用 中药新的、便捷、准确的分子标识鉴定方法的研究 从基因层次,为过去不能很好解决的问题如道地药材的研究、药材品
质的定向调控等提供了新的方法和思路。
分子生药学研究重点

药用植物的分子系统学研究 药用植物种质资源的分子生物学研究 生药的分子鉴定研究 道地药材形成的分子机理研究 珍稀濒危中药资源的遗传多样性分析和保护策略研究 药用植物的抗性基因工程研究 药用化学成分的生物转化及分子机理研究 药用植物有效成分生物合成分子机理与调控的研究和药用植物细胞 组织和转基因器官培养与活性成分生产等
分子生药学研究策略
分子遗传标记技术
通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其 外在性状表现规律的技术。任何生物种或个体都具有特定的DNA 多态性，通过直接诊断分析DNA 的多态性，便能避开遗传特性表 现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰，快
速准确地鉴定药材真伪。
分子生药学研究方法
遗传标记 （Genetic marker) 遗传学中通常将可识别的等位基因称为遗传标记。 但随着遗传学和基因概念的发展其内涵也发展。除基 因标记外遗传标记主要包括：
1.形 态 标记： 是指那些能够明确显示遗传多态的外 观性状，如株高、粒色等的相对差异 2.细胞学标记 ：是指能够明确显示遗传多态的细胞学特征。 如染色体结构上和数量上的遗传多态性等 3.蛋白质标记：非酶蛋白质和酶蛋白质在非酶蛋白质中，用得较 多的是种子贮藏蛋白；酶蛋白质主要是同功酶。 4.DNA 标 记：也称DNA多态性标记、 DNA分子标记， 是 DNA水平上遗传多态性的直接反映。
化、标准化、国际化之路。


类生药； 鉴定药材道地性； 鉴定生药野生与家种； 刻划生药质量标准化； 鉴定中药原粉制剂。