• (3)染色 • (4)镜检
• 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对 染料的亲合力不同的原理，用不同染料 进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色 而便于区别。
主要步骤：
• • • • • • 制片(按常规涂片，干燥，固定) 加热染色 脱色 复染 水洗 镜检
细菌芽胞染色技术
芽孢染色法染色结果：位于红色细胞内绿色的为芽胞
革兰阳性菌及革兰阴性菌细胞壁结构及意义的比较
细胞壁 结构 革兰阳性菌 革兰阴性菌 细胞壁强度 较坚硬 较疏松 肽聚糖层数 可达50层 1～2层 肽聚糖含量 50～80% 5～20% 磷壁酸 有 无 外膜 无 有 五肽交联桥 有（三维结构） 无（二维结构） 革兰染色 阳性（紫色） 阴性（红色） 青霉素和溶菌酶 敏感 不敏感
外膜 G-细菌在肽聚糖层外面还有三层结构
脂蛋白：由脂质和蛋白质构成 外膜 脂质双层 类脂A 内毒素的毒性部分,无特异性 脂多糖 核心多糖 有属或组的特异性 寡糖重复单位 由3-5个单糖组成， 有种或型的特异性 脂质双层 是G-菌细胞壁的主要结构，占细胞壁干 重的80%，结构类似细胞膜，为液态的脂质双层， 又称外膜
观察细菌的方法
1. 观察工具（tools）
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 电子显微镜
二、显微镜的基本结构及油镜的工 作原理
1、普通光学显微镜的基本结构
普通光学显微镜分两部分： 1）机械装置：镜座、镜筒、镜臂、物镜转换器、载物 台、标本移动螺旋、粗调螺旋和细调螺旋等部件组成。 2）光学系统：目镜、物镜、聚光器、虹彩光圈、光源 等组成
杆菌
革兰氏染色
革兰氏染色是采用二种染料对细菌细胞进行染色， 初染采用的是结晶紫，复染采用的是番红。 G＋菌：细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，基本不含类脂， 肽聚糖分子交联度较紧密，故经乙醇处理后，肽聚糖网 孔因脱水而明显收缩，使壁的通透性降低保留着结晶紫 －碘复合物，所以复染液番红不能进入,细胞显紫色。 G- 菌：细胞壁薄，肽聚糖含量低，类脂含量高，肽聚糖 分子交松散，故经乙醇处理后，壁会出现较大的缝隙， 细胞透性增大，结晶紫－碘复合物易被洗脱出来，再经 番红复染后使细胞显红色。
⑴
胞浆颗粒(cytoplasmic granules):储藏营 养。异染颗粒：染成与细菌其他部分 不同的颜色，如：白喉杆菌--鉴别
⑵ ⑶
质粒(plasmid)：
质粒： 染色体外的遗传物质 双股环状DNA 携带某些遗传信息，控制某些遗传性状 R质粒（resistance plasmid) : 耐药性质粒 F质粒（fertility plasmid) ： 致育性质粒 Vi质粒 (virulence plasmid): 毒力质粒
使用方法
荧光显微镜
(4)某些成分与致病性有关
细菌的结构
荚膜 中介体 菌毛 鞭毛 胞质颗粒
细胞壁
细胞膜
核糖体
核质DNA
细胞质
细菌细胞壁所特有成分 由多糖骨架、四肽侧链和交联 桥3部分组成
磷壁酸（techoic acid） 革兰阳性菌特有成分,是由核糖醇或 甘油残基经磷酸二酯键相互连接而成 的多聚物。 作用： (1)调节离子通过粘肽层，有保存和 输送镁离子的作用； (2)为噬菌体的特异性受体； (3)与细菌的致病性有关； (4)具有抗原性可用于细菌的分型。
普 通 光 学 显 微 镜 基 本 构 造
放大倍数=
物镜放大倍
数×目镜放
大倍数
低倍镜的操作
1. 置显微镜于固定的桌上。
2. 旋动转换器，将低倍镜移到镜筒下方与之对直。
3. 转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜，仔细观 察，视野亮度均匀。 4. 将标本放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔的正 中央。 5. 将粗调节器向下旋转，眼睛注视物镜，以防物镜和载 玻片相碰，当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。 6. 左眼向目镜观察，调节粗、细调节器直至目的物清晰
4.芽胞(endospore or spore)： 定义:细菌在一定环境条件下，胞浆脱水浓缩， 在菌体内形成的多层膜状结构的圆形或卵圆形 小体。 形成条件：缺乏营养物质，有害代谢产物堆 积 性质：是休眠状态，不是繁殖方式 功能 对细菌起保护作用：多层膜包绕，通透性降 低 芽孢死亡作为灭菌是否彻底的指标
细菌的形态结构及观察
一、细菌的形态结构 二、细菌的观察方法 三、显微镜的使用方法
第一节 细菌的大小与形态
1.大小：个体微小，通常以微米
（μm）为测量单位
2.基本形态：有三种:球状、杆状、
螺旋状，分别称为球菌、杆菌
和螺形菌
球菌
杆菌
螺型菌
• 细胞壁（cell wall）: 细胞壁是位于细菌细胞 膜外的一层坚韧而有弹性的膜状结构。 • 功能 • （1）维持细菌固有外形，保护细菌不受外界 低渗环境的破坏； • （2）与细胞膜共同完成胞内外的物质交换； • （3）决定细菌的抗原性。
为止。
油镜的操作
1. 如果用高倍镜未能看清目的物，则可用油镜。应先用
低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。
2.下降载物台在载玻片上滴一滴香柏油，将油镜移至正中 央，使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细
暗视野显微镜是光学显微镜的一种，也叫超显微镜。 暗视野显微镜的聚光镜中央有挡光片，使照明光线 不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线 进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是 亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微 粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。
Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells
鞭毛是细菌的运动“器官”，一 般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为 0．01—0．02μm。 鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的 沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以 加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色。
主要步骤：
• (1)选菌（用新培养的菌种为宜） • (2)制片
㈡ 细菌的特殊结构
荚膜、芽胞、鞭毛、菌毛
1.荚膜(capsule)
定义：某些细菌胞壁外围绕一层较厚的粘液性物
质，称为荚膜。
形成条件：动物体内、营养丰富的培养基内
化学成分：多糖 分类：荚膜、微荚膜、粘液层----糖被 功能：鉴别细菌、分型依据（因有抗原性） 致病性有关（抵抗吞噬、消化等）
2. 鞭毛（flagellum） 定义：为附着在某些菌体上的细长 而 呈波状弯曲的丝状物 种类：单毛菌：如霍乱弧菌 双毛菌：如空肠弯曲菌 丛毛菌：如铜绿假单胞菌 周毛菌：如伤寒沙门菌 化学成分：蛋白质 性质：是运动器官
功能 ：与致病性有关：粘附性
3.菌毛(fimbria or pili)
定义：某些细菌表面遍布着比鞭毛 纤细、短而直的丝状物。只 有在电镜下才能观察。 化学成分：主要是蛋白质 菌毛的种类与作用： ① 普通菌毛：数量多，粘附于受体 上---致病性 ② 性菌毛：少，雄性菌 （F+) ，雌性 菌（F-)---接合；噬菌体吸附受体
2 细胞膜(cell membrane)
细胞壁与细胞质之间
半渗透性的生物膜
脂类双层，镶有蛋白质 功能：渗透和运输、生物合成 （肽聚糖、磷壁酸、脂多糖等）、呼 吸作用、参与细菌分裂。另外，细胞 膜是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转 的供能部位。
3 细胞质
是细菌进行新陈代谢的主要场所。 含有以下颗粒： 核糖体(ribosome)：合成蛋白质的 场所
革兰氏染色法（Gram Stain）
由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。
步骤：
涂片固定 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色
结果:
阳性菌——紫色 阴性菌——红色
番红复染
Figure
Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.
• 一 细菌的染色方法
• 二 显微镜的使用方法
三 、细菌染色法:
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法
细胞壁染色法
抗酸染色
革兰氏染色
1.简单染色 2.革兰氏染色 3.鞭毛染色 4.芽孢染色
• 用于生物简单染色的染料主要有碱性、 酸性和中性染料三大类
• 简单染色法是只用一种染料使细菌着色 以显示其形态（简单染色不能辨别细菌 细胞的构造）
主要步骤:
• • • • （1）涂片：直接在载玻片上制薄的涂面 （2）晾干：让涂片自然晾干 （3）固定：菌膜朝上，通过火焰2-3次固定 （4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的 搁架上，加复红染色1-2min。 • （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液 • （6）干燥：将涂片放在空气中晾干 • （7）镜检：在涂片上加香柏油一滴，将油镜 头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。