(10)授权公告号 (45)授权公告日 2014.11.12C N 103114082B (21)申请号 201310069093.9(22)申请日 2013.03.04C12N 9/36(2006.01)(73)专利权人浙江工业大学地址310014 浙江省杭州市下城区潮王路18号(72)发明人张健 金志敏 夏春年 姚小武张岩(74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司 33201代理人黄美娟 王兵CN 1108381 C,2003.05.14,陈若飞.从蛋壳中提取溶菌酶的研究..《沈阳化工学院院报》.2008,卢庆祥.用聚丙烯酸凝聚提取溶菌酶..《化学教学》.1995,M. Sternberg 和D. Hershberger.Separation of proteins with polyacrylic acids..《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 》.1974,(54)发明名称一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法(57)摘要本发明公开了一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法：用水将鸡蛋清溶解，调节pH 至4.0～5.0并加热至80℃左右，使杂蛋白沉淀、过滤除去，获得滤液；再在弱酸性条件下，用木质素磺酸钠与滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀；然后，将沉淀物在碱性条件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解离，过滤得滤液；最后，向滤液中加入无水乙醇使其结晶，过滤、干燥即得溶菌酶；本发明使用的原材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工业化生产。
(51)Int.Cl.(56)对比文件审查员 孙彦珂权利要求书1页 说明书5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利权利要求书1页 说明书5页(10)授权公告号CN 103114082 B1/1页1.一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行：（1）将鲜鸡蛋清用水稀释后，搅拌均匀，调节pH 值至4.0～5.0后立即加热至80～85℃，保温10～15min ，水浴冷却至20～35℃后静置6～10h ，过滤，获得滤液a ；（2）将步骤（1）获得的滤液a 调pH 值至4.5～6.5，搅拌下，缓慢加入木质素磺酸钠至有沉淀生成，静置3～9小时，过滤，取滤饼用Na 2CO 3水溶液溶解完全后，再缓慢加入聚丙烯酰胺水溶液至无沉淀产生，静置4～8小时，过滤，获得滤液b ；所述木质素磺酸钠以质量浓度10%～20%的木质素磺酸钠水溶液的形式加入，所述木质素磺酸钠水溶液与滤液a 的体积比为0.4～1.2：1；（3）向步骤（2）获得的滤液b 中缓慢加入无水乙醇至产生白色沉淀，静置，过滤，将滤饼冷冻干燥，获得所述溶菌酶。
2.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤（1）用质量浓度5%的盐酸来调节pH 值。
3.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤（2）中将步骤（1）获得的滤液a 用质量浓度5%的NaOH 水溶液调pH 值。
4.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于：步骤（2）中的木质素磺酸钠的相对分子量为4000～10000。
5.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于：步骤（2）中Na 2CO 3水溶液的质量浓度为3～10%。
6.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于：步骤（2）中聚丙烯酰胺水溶液的质量浓度为5%～25%。
7.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤（2）加入木质素磺酸钠的温度为15～40℃，所述加入聚丙烯酰胺水溶液的温度为15～40℃。
8.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤（2）中聚丙烯酰胺的相对分子量为300万～800万。
9.如权利要求1所述的从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，其特征在于步骤（3）所述加入无水乙醇的温度为15～40℃。
权 利 要 求 书CN 103114082 B一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法（一）技术领域[0001] 本发明涉及一种溶菌酶的制备方法，特别涉及一种鸡蛋清中分离溶菌酶的方法。
（二）背景技术[0002] 溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
溶菌酶在临床上是有效的消炎剂，在食品防腐和基因工程等方面也有广泛的应用。
溶菌酶来源很广，在人、动物、植物和微生物中均有发现，其中鸡蛋清中含量最高，因此，工业生产溶菌酶常以鸡蛋为原料。
[0003] 从鸡蛋中溶菌酶的提取方法报道很多，有直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、沉淀法、双水相萃取、超滤法等。
各种方法优缺点不一，产品的质量和生产成本也有所不同。
目前，沉淀法是一种工业上应用比较成熟的提取方法，其在技术要求和生产成本上都比较好。
[0004] 其中，生吉萍等【中国食品学报，2003年增刊，10～14】用等电点沉淀法，即先将获取的蛋清液用NaCl 溶液稀释，再用1mol/L 的NaOH 溶液将蛋清pH 值调到9.5～11.0，使其接近溶菌酶的等电点，并4℃下静置，从而使溶菌酶沉淀下来。
这种方法操作简单，在工业生产中可以使产品的成本大大降低。
但是其生产周期较长，产率相对偏低，纯度不高，高纯度产品获取过程复杂，需要增加较多步骤。
[0005] 康旭、邓川等采用盐析沉淀法【畜牧与饲料科学，2010，31(5)，91～92】，即用pH 值为6.5的磷酸盐缓冲液(PBS)将蛋清稀释5倍，在搅拌和除去杂蛋白后，用硫酸铵对上清液分级沉淀，取40％～80％饱和度部分的沉淀，得溶菌酶。
得到的溶菌酶纯度达到电泳纯，其中用80％左右饱和度硫酸铵时收率最好。
此法得到的溶菌酶纯度和产率都比较高，但是依旧存在沉淀速度慢及不完全的问题，因而使得溶菌酶的活性降低了很多。
[0006] 陈若飞用聚丙烯酸沉淀法从蛋壳中提取溶菌酶【沈阳化工学院学报，2008年9月第22卷第3期222～225】，在除去杂蛋白后，加入NaOH 溶液调pH 至6.0，加入聚丙烯酸，产生乳白色胶状物。
将聚合物用Na 2CO 3将其溶解，并pH 调至9.5，加入质量分数为5％的CaCl 2液将溶菌酶聚丙烯酸解离，接着过滤得到澄清溶液。
最后加入NaOH 溶液调pH 为10.5左右，使溶菌酶结晶析出。
此法选择性好，得到的溶菌酶纯度很高，但是聚丙烯酸价格较贵，而且水溶液的黏性较大，不方便大规模生产。
[0007] 文章军和钱生球在其专利【一种分离溶菌酶的方法】中描述，以蛋清为原料，加水稀释后，搅拌均匀，用酸调pH 至4.0～5.0，静置，除去沉淀，再将溶液升温至75～80℃，冷却静置，过滤得上清液，然后用碱调pH 至7.5～8.0，加入乙醇至产生沉淀，静置6～10小时后过滤，干燥沉淀溶菌酶。
其工艺步骤简单、生产周期短、除杂蛋白效果较好、收率也比较高，但是最后所得酶的活性不是特别高。
[0008]国外，研究者用N-异聚丙烯酰胺与丙烯酸单体的共聚物从蛋清中，【Journal of Biotechnology ，87(2001)，95～107】，虽然得到的产品纯度高、收率高、活性也比较好，但是生产的成本高，而且操作十分复杂。
[0009] 溶菌酶为白色或微白色冻干粉，可溶于水，不溶于乙醚和丙酮。
相对分子量在14000左右，pI在10.5～11.0，最适存在和反应的pH值为6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃或pH值为3条件下，15min后活力保持87%。
而蛋清中的其他蛋白的pI在4.0～5.0，在80℃以上的高温下易失活，所以，可以用等电点沉淀法除杂蛋白。
由于溶菌酶的pI太高，此时采用等电点沉淀产生一定量的失活，但溶菌酶在弱碱性条件下，会在乙醇作用下结晶，所以可以用乙醇使其结晶而分离。
[0010] 此外，木质素磺酸钠可以溶解在碱性的水溶液中，而且在实验研究中发现，木质素磺酸钠可以在弱酸条件下与溶菌酶生成聚合物沉淀。
所以本发明就是利用这种聚合沉淀的方法提取分离蛋清中溶菌酶。
[0011] 而聚丙烯酰胺作为水溶性高分子聚合物，具有良好的絮凝性，本身无毒副作用，且聚丙烯酰胺易与木质素磺酸盐生产凝聚物。
蒋成新在研究中，有利用聚丙烯酰胺和木质素磺酸钠复合【石油钻采工艺，1988年专辑（22）2,193～202】，生成复合铬冻胶堵水剂。
而本发明则是利用聚丙烯酰胺水溶液与木质素磺酸钠结合，生成沉淀，而使木质素磺酸钠和溶菌酶的聚合沉淀解离，达到得到分离。
[0012] 所以本发明使用的原材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工业化生产。
（三）发明内容[0013] 本发明目的是提供一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，使用的原材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工业化生产。
[0014] 本发明采用的技术方案是：[0015] 一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法，所述方法按以下步骤进行：[0016] （1）将鲜鸡蛋清用水稀释后，搅拌均匀，调节pH值至4.0～5.0后立即加热至80～85℃，保温10～15min，水浴冷却至20～35℃后静置6～10h，过滤，获得滤液a；[0017] （2）将步骤（1）获得的滤液a调pH值至4.5～6.5，搅拌下，缓慢加入木质素磺酸钠至有沉淀生成，静置3～9小时，过滤，取滤饼用Na2CO3水溶液溶解完全后，再缓慢加入聚丙烯酰胺水溶液至无沉淀产生，静置4～8小时，过滤，获得滤液b；[0018] （3）向步骤（2）获得的滤液b中缓慢加入无水乙醇至产生白色沉淀，静置（15～40℃下静置3～5h），过滤，将滤饼冷冻干燥，获得所述溶菌酶。
[0019] 进一步，步骤（2）中将步骤（1）获得的滤液a用质量浓度5%的NaOH水溶液调pH 值，优选调pH值至5.5～5.8。
[0020] 进一步，步骤（2）中木质素磺酸钠相对分子量为4000～10000。
[0021] 进一步，步骤（2）中木质素磺酸钠以质量浓度10%～20%的木质素磺酸钠水溶液的形式加入，所述木质素磺酸钠水溶液与滤液a的体积比为0.4～1.2：1，优选0.8:1。
[0022] 进一步，步骤（2）中Na2CO3水溶液的质量浓度为3～10%，优选5%。
[0023] 进一步，步骤（2）中聚丙烯酰胺水溶液的质量浓度为5%～25%，优选10～15%。
[0024] 进一步，步骤（2）加入木质素磺酸钠的温度为15～40℃，优选25℃；所述加入聚丙烯酰胺水溶液的温度为15～40℃，优选25℃。
[0025] 进一步，步骤（2）中聚丙烯酰胺的相对分子量300万～800万。