《生物饵料培养学》实验讲义王珺冯永勤海南大学海洋学院2010年6月目录实验一单细胞藻浓度的测定 (1)实验二单细胞藻培养的容器、工具及用水的消毒 (3)实验三单细胞藻培养液--母液的配制 (5)实验四单细胞藻一级培养 (7)实验五轮虫的分离与培养 (9)实验一单细胞藻类浓度的测定【实验目的】1.掌握用血球计数板计数单细胞藻类的方法。

2.掌握使用分光光度计进行单细胞藻类计数的原理、方法。

【实验原理】1. 制作工作曲线。

取一定量的单胞藻液，稀释成5个梯度，分别用分光光度计测定其吸光度（O.D.），并用血球计数板测定相应藻液的藻细胞个体浓度，由于藻细胞浓度与吸光值的大小成正比关系，根据各组数据绘出吸光度-藻细胞浓度的相关曲线，即工作曲线。

1.1 血球计数板计数的原理血球计数板是一块比普通载玻片厚的载玻片特制而成的，板的中部有一“H”形的凹沟，在凹沟包围的上、下两块地方比凹沟外的两条高起的边低0.1mm，在此部的中央划线为一具有准确面积的大小方格，在其中分为九个方格，每一大方格的面积是1mm2，在四角的大格又分为16个中格，在中央的大格分为25个中格，每一中格分为16个小格，共400个小格；另外一种计数板的中央大格分为16个中格，每一中格分为25个小格，总数400个小格，加盖玻片后，每一大格即形成一个体积为0.1mm3的空间。

2．测定被测藻液的吸光度。

3．根据工作曲线查出藻液相应吸光度的藻细胞浓度。

【实验用品】一、实验器材分光光度计、显微镜、电子天平、干燥箱、血球计数板、计数器。

二、试剂鲁哥氏液。

三、实验材料25或50ml比色管（每组6支）、吸管、擦镜纸、单胞藻液500ml、待测藻液500ml、10ml 移液管（每组6支）、50ml试剂瓶、消毒海水500ml、蒸馏水。

【实验步骤】一、分光光度计计数法1. 制作工作曲线取单胞藻液20ml置于比色管中，并稀释成5个浓度梯度（建议第一浓度是第二浓度的2倍，依次类推），以培养液作为参比，用分光光度计分别测定其吸光度（O.D.），并用血球计数板测定相应藻液的藻细胞个体浓度，由于藻细胞浓度与吸光值的大小成正比关系，根据5组数据绘出吸光度-藻细胞浓度的相关曲线，即工作曲线。

1.1 用培养液作为参比，分别测定相应的5个浓度梯度藻液的吸光度（绿色的藻类一般选择的波长为720-750nm；金藻门藻类、硅藻门藻类一般选择的波长为420nm）。

1.2 用血球计数板分别计数工作曲线用的藻细胞浓度。

1.2.1 把血球计数板及盖玻片擦洗清洁、平放在桌上、并盖好盖玻片。

1.2.2摇匀工作曲线用的藻液，用一支干净的平口微吸管吸取藻液，迅速把吸管放在计数板旁的盖玻片边缘处，轻压橡皮头，使藻液流入计数板内（如果样品是有运动能力的种类，则应加入碘液杀死，才能取样计数）。

1.2.3 稍停一分钟后，在低倍镜下（细胞太小需用40×10倍）计数中央大格（400个小格）和东北、西北、西南、东南等4个大格（16个中格），每个样品重复计数两次，然后取其平均值。

得：1ml水体的藻类细胞数目=计数平均值×稀释倍数×10000个（简记：万个/ml）2．测定被测藻液的吸光度。

3．根据工作曲线求出藻液相应吸光度的藻细胞浓度（或由公式：被测藻液的藻细胞浓度=工作曲线中总的藻细胞浓度/工作曲线中总的吸光度×被测藻液的藻细胞吸光度）。

【注意事项】1.血球计数板计数时，藻液不能溢出盖玻片上方，若有溢出，需冲洗干净，重新取样，注意控制藻液流入量，不能过多，也不能过少，应充满计数板的部分，不能有气泡。

2.应注意摇匀后，再取样进行测定或计数。

3.如果藻细胞浓度太大，应稀释后才计数，计数结果应乘以稀释倍数。

4.运动的藻类，应杀死后才能计数。

（建议：稀释液中含有固定液）【作业与思考】1.绘制工作曲线。

2.计算出你测定的单细胞藻的细胞密度。

3.你是如何减少计数所造成的误差？实验二单细胞藻培养的容器、工具与用水的消毒【实验目的】学习并掌握培养单细胞藻的容器工具及用水的消毒方法，为今后成功培养单细胞藻打基础。

【实验原理和基础知识】单细胞藻培养用的工具、容器及水都必须经过严格消毒，尽可能杀死一切生物，以免污染影响藻类生长和繁殖。

【实验用品】一、实验器材仪器设备：恒温干燥箱、电炉、电子天平、充气泵。

工具容器：250ml三角烧瓶（每人2只） 400ml烧杯30只3000ml三角烧瓶10只 (6人/组) 搅拌棒 20根移液管（5或10ml） 30支塑料桶 4个移液管（1ml） 30支乳胶管若干容量瓶（100ml） 30只量筒100ml 30只二、药品浓硫酸、重铬酸钾、漂白水或次氯酸钠溶液、硫代硫酸钠。

洗液的配制方法：称15g重铬酸钾至干燥的烧杯中，然后加入200ml粗硫酸，搅拌并加热至重铬酸钾溶解，即得洗液，冷却后将上清液倒入试剂瓶中备用。

三、实验材料海水200L、淀粉碘化钾试纸2包、充气管、充气石10粒。

【实验操作步骤】一、工具、容器消毒方法1．洗液消毒法所有待用三角瓶、烧杯、容量瓶等玻璃器皿均先用自来水（加去污粉）冲刷干净，然后倒入少许洗液，沿着内壁慢慢转动器皿，使其全部浸泡，放置10min后，将底部洗液回收（以备后用），然后用自来水冲净瓶子，把瓶口朝下晾干。

移液管应用洗耳球吸取洗液，使其浸泡内壁，10min后，用自来水冲净内、外壁。

2．烘箱干热消毒法将洗净、凉干的玻璃器皿（移液管、金属工具等应用报纸或牛皮纸包扎好），扎瓶口用的纸，棉塞均放入烘箱。

打开通气孔，接通电源，加热，待温度上升至120℃时关闭通气孔（在升温过程中，如果绿灯熄灭，红灯亮，表示箱内停止加热），恒温2h后，断电停止加热，然后待温度自然冷却至60℃以下，才能打开烘箱门取出容器、工具（实验室保种通常并用洗液消毒法和加热消毒法）。

3．煮沸消毒小型的容器、工具可放入锅中，加水煮沸消毒15-30min，可杀死细菌的营养体，如果在水中加入2%Na2CO3可促使芽孢死亡。

较大的三角烧瓶，可在瓶内加少量淡水，套上纸或放一只普通的玻璃漏斗，煮沸消毒15-30min，可使整个瓶壁消毒。

然后倒出淡水，盖上消毒的牛皮纸。

二、培养用水的消毒方法1.脱脂棉过滤法取一桶海水置于高处，接好过滤装置、然后控制夹子，慢慢滴水过滤2L。

2．加热煮沸消毒法将经脱脂棉过滤的海水，放至电炉烧开，冷却至室温（实验室保种通常并用脱脂棉过滤和加热煮沸法）。

3．漂白水消毒法每人取2L过滤海水加入漂白水（含有效氯10﹪）0.5ml，搅拌均匀后盖上以防氯气逸出。

静止放置16-24 h时消毒后再加入等量硫代硫酸钠中和，充气2 h，然后用淀粉碘化钾试纸测试是否有余氯（单胞藻二级培养、三级培养常用）。

试纸无变蓝表明无余氯存在，即可使用。

【注意事项】1.用加热法消毒培养用水时，三角瓶内的水量不能超过瓶子的2/3，瓶外面不能有水珠，瓶口用纸盖住，不要绑紧。

2.洗液在瓶子内转动时，注意瓶口不能对着自己，也不能对着他人。

3.干热灭菌过程中，实验者不能离开，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。

4.烘箱内的温度需冷却至60℃以下，才能打开烘箱门取出工具、容器。

【作业与思考】1. 培养单细胞藻的工具、容器的消毒有哪几种方法？2. 单细胞藻培养用水的消毒有哪几种方法？3. 单细胞藻藻种应如何保藏？实验三单细胞藻培养液--母液的配制【实验目的】掌握培养液配制的原理、一般方法和步骤，为今后成功培养单细胞藻打基础。

【实验原理和基础知识】单细胞藻大量生长繁殖，必须从环境中吸收各种营养元素，包括氮、磷、铁和微量元素等单细胞藻在不同配方的培养液中生长效果不同，因此要根据各种单细胞藻的生理需求选择合适的培养液。

把营养元素根据培养液配方进行高浓度配合（而且稀释液用蒸馏水或去离子水），一般浓缩1000倍，配成母液。

目的是培养方便，母液不能直接用于培养单细胞藻类，必须稀释后才用。

一般每升消毒海水或淡水中加入1ml母液，即为培养液。

【实验用品】一、实验器材电子天平、电炉、容量瓶、烧杯、搅拌棒、试剂瓶、100ml量筒、吸管、10ml移液管、耳球、微量注射器。

二、药品NaNO3、（NH2）2CO、KH2PO4、FeSO4.7H2O、MnSO4、EDTA-Na2、V B1、V B12、Na2SiO3 。

三、实验材料蒸馏水【实验操作步骤】1．“宁波大学3号”培养液配方（母液）NaNO3 100g FeSO4.7H2O 2.5gKH2PO4 10g MnSO4 0.25gEDTA-Na2 20g V B1 60mgV B12 50µg蒸馏水 1000ml培养海水绿藻类、金藻类、硅藻类等使用。

在培养硅藻时在此基础上加入0.02g/L Na2SiO3，培养螺旋藻时应加2g/L的NaHCO3 。

2.配制步骤：（1）称量和溶解配制母液100ml。

按配方先称取NaNO3放入干净的烧杯中，加入约60ml蒸馏水，搅拌使NaNO3 完全溶化。

然后再依次称取其他各成分，逐一溶解，最后一起倒入100ml容量瓶，再用蒸馏水冲洗烧杯2-3次，并转移到容量瓶中，最后用蒸馏水加至刻度。

（在本配方中FeSO4、MnSO4应与EDTA-Na2一起加热溶解）（2）压紧容量瓶盖，将容量瓶上下颠倒n次，使其混合均匀，倒进经消毒的试剂瓶内，并贴上标签（母液名称、配制人、日期）。

（3）配制0.5% Na2SiO3称0.5g Na2SiO3置于干净的烧杯中，加入约60ml蒸馏水，搅拌溶解，倒进100ml容量瓶，用蒸馏水冲洗烧杯2-3次并转移至容量瓶中，定容100ml。

上下颠倒容量瓶n次，使其混合均匀，倒进经消毒的试剂瓶内，并贴上标签（贮液名称、浓度、配制人、日期）。

【配制母液应注意事项】1.各种营养盐应逐一称量、逐一溶解，倒进容量瓶定容，然后再倒入试剂瓶保存。

2.稀释液必须加蒸馏水或去离子水。

3.难溶解的物质必须与EDTA-Na2一起络合加热溶解。

4.待温度冷却至低于60℃时，才能加入维生素，以免失效。

5.注意加入烧杯中溶化营养盐的水量应少于所需要定容的水量。

【作业与思考】1．单细胞藻类培养液配制的操作过程中应注意什么问题？2．单细胞藻类的全培养液配方应包含哪些成分?3．试述该配方中的N、P比是多少？实验四单细胞藻一级培养【实验目的】掌握单细胞藻一级培养的基本操作与管理，从而有可能做到有计划地培养足够数量的符合质量的单细胞藻。

【实验原理和基础知识】单细胞藻在适宜的生态条件下可以生长繁殖，在不同配方的培养液中生长效果不同，因此要根据各种单细胞藻的生理需求选择合适的生态环境和营养盐进行培养。

【实验用品】一、实验器材恒温干燥箱、250ml三角烧瓶、电炉、温度计、盐度计、3000m烧瓶、10m移液管、100ml 量筒、扎瓶口的牛皮纸、橡皮圈、长镊子、剪刀、标签纸、（配制培养液用：电子天平、电炉、烧杯、搅拌棒、容量瓶、试剂瓶）。