基于核磁共振技术的定量代谢组学研究江春迎, 王映红*(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050)摘要: 核磁共振技术 (NMR) 既可用于混合体系的定性分析, 又可以用于其定量分析。
在过去的几十年里,随着分析技术以及各种实验技术的迅速发展, 基于核磁共振的定量分析方法已广泛应用于生物样本的分析。
核磁共振定量分析技术应用于代谢组学, 并成为定量代谢组学 (quantitative metabolomics) 研究中的重要手段。
本文将论述这种新分析方法相比于传统方法的优势及不足之处, 同时论述其研究过程中需考虑的重要因素以及其在代谢组学研究中的应用。
关键词: 核磁共振; 代谢; 代谢组学中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2014) 07-0949-07Quantitative metabolomics based on NMRJIANG Chun-ying, WANG Ying-hong*(State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)Abstract: Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can be used to both identify and quantify chemicals from complex mixtures. Over the last several decades, significant technical and experimental advances have made quantitative nuclear magnetic resonance (qNMR) a valuable analytical tool for quantitative measurements of a wide variety of samples. This particular approach is now being exploited to characterizethe metabolomes of many different biological samples and is called quantitative metabolomics or targeted metabolic profiling. In this review, some of the strengths, limitations of NMR-based quantitative metabolomicswill be discussed as well as the practical considerations necessary for acquisition with an emphasis on their use for bioanalysis. Recent examples of the application of this particular approach to metabolomics studies will be also presented.Key words: qNMR; metabolism; metabolomics代谢 (metabolism) 是生命活动中所有生物化学反应的总称, 代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础。
因此, 对代谢物的分析向来就是研究生命活动分子基础的一个重要突破口。
由于生物化学反应是连续的, 多数代谢途径之间相互关联, 代谢是以网络的形式在生物系统中发挥作用的, 要认识代谢系统的整体性和网络化, 就需要从整体出发, 采用综合与收稿日期: 2013-12-15; 修回日期: 2014-03-15.*通讯作者 Tel: 86-10-63165216, E-mail: wyh@ 系统的策略, 即系统生物学的思想[1, 2], 这种研究哲学的转变促成了代谢组及代谢组学概念的诞生[3, 4]。
它与基因组和基因组学、转录和转录组学、蛋白组和蛋白组学等一起构成了系统生物学, 是整体系统生物学的重要组成部分。
代谢组分析主要使用色谱−质谱联用技术 (GC- MS或LC-MS) 和核磁共振波谱技术 (NMR)。
NMR 的优点非常明显: ① NMR样品只需要简单的预处理, 尿液和血清是经常使用的样品; ②无损伤性, 不会破坏样品的结构和性质; ③可在接近生理条件下进·综述·行实验, 可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件; ④可以进行实时和动态的检测; 丰富的谱编辑技术可以在不分离样品的情况下, 部分分离和归属复杂样品中的代谢物的信号; ⑤混合物中不同代谢物的NMR响应系数一致, 属于无偏向检测技术;⑥ NMR谱中信号强度与样品浓度成正比, 可以对代谢物进行定量分析[5]。
因此, NMR方法很适合代谢产物中复杂混合成分的研究。
鉴于以上优势, 以核磁共振波谱学技术为基础的代谢组分析技术已得到快速发展和较为广泛应用[6−8]。
但基于核磁技术的代谢组学研究也存在两个瓶颈问题。
首先, 与质谱比较, 其灵敏度较差, 近些年来, 由于磁场的提高 (1 000 MHz)、低温探头及微量探头的应用, 使其灵敏度有了很大的改善, 相信随着核磁技术的不断发展, 还将不断改进。
其次, 核磁谱中多种内源性代谢物谱峰重叠严重, 影响了对代谢物的定性及定量分析。
本文将对后一个问题在基于核磁技术的代谢组学研究中的解决方法进行归纳综述。
很多生物样品(组织提取物和体液等) 的核磁共振图谱可包含高达5 000多个的响应信号[1]。
对于分析者来说, 如何从大量的核磁图谱数据中获取有意义的信息是一项具有挑战性的工作。
代谢组学数据分析是利用分析化学中的化学计量学或化学信息学的研究方法将这些(海量) 数据进行统计和归类分析, 从而提取代谢特征或代谢时空的整体变化轨迹。
研究之初, 人们采用Binning法对数据进行处理[9, 10]。
此方法将NMR图谱划分为一系列一定宽度的小区域, 每个小区域称为一个bin, 随后对每个bin下的面积进行积分, bin的化学位移及积分面积可提供内源性代谢物特征峰及其浓度变化信息, 利用其进行统计分析, 从而大大简化了数据, 使不同生理状态生物样品的差异有效的进行可视化呈现[11]。
另外一种方法即定量代谢组学 (quantitative metabolomics) 法或靶标轮廓法 (targetd metabolic profiling) 与Binning的主要不同在于, 不再依赖bin的积分面积对浓度进行半定量分析, 而是利用数据库, 对代谢物进行较为精确的定性, 然后采用内标法获得其绝对浓度[12, 13], 最后利用绝对浓度进行统计学分析。
1 Binning与定量代谢组学的比较作为传统代谢组核磁共振图谱分析法, Binning 法拥有众多优点。
首先, 它可以很大程度上简化图谱, 使得后期分析更加快速、简便; 其次, 分析人员根据分析的需要, 可设定不同的bin宽度值[14], 以达到简化数据的目的。
例如, 当bin宽度为0.04 ppm时, 一个64K点的图谱可简化为250个变量; 另外, 它还可以一定程度上实现自动化分析功能, 从而降低大批量样本分析对分析人员的要求。
但是就像其他分析方法一样, Binning方法不是完美的。
在实际操作中, Binning有两个主要的问题: ①对酸碱度、离子强度等变化造成的化学位移偏差适应性不理想, 从而导致数据的不统一, 影响分析的可靠性; ②分析结果不一定存在实际意义[15, 16], 即在后期的统计学数据分析得到的结果可能仅仅只能提示一些特定区域的信号值得注意, 但是由于图谱中信号的重叠以及基线的矫正等人为因素的影响, 致使真假信号无法区分。
例如, 在血浆样本中, 甜菜碱与葡萄糖重叠, 因此, 难以获得甜菜碱的浓度的变化(图1)。
Figure 1 Typical 500 MHz 1H NMR spectra of plasma samples and corresponding spectral regions of some plasma metabolites. Assignments: glucose (red); choline (green); betaine (blue) 定量代谢组学研究, 可以避免Binning的这些缺点,在相关的商业软件中,通过去卷积(deconvolution) 和线性叠加 (linear superposition) 方法对NMR谱图进行拟合, 较好地解决了谱峰重叠造成的定性分析困难问题, 同时也增加了定量分析的准确性。
软件考虑了生物样本的多样性、酸碱度、离子浓度、温度等多方面因素造成的图谱的差异, 其数据库包含样品在不同场强 (100～800 MHz)[12]、不同pH值及不同温度下的谱图, 因此, 具有一定的实用性。
这种定量分析方法的主要优点有: ①样品不需要复杂的前处理, 因此适用于多种生物样品的分析; ②不需要特殊的采样条件; ③分析结果不受样品pH值和离子强度的影响; ④即使对化合物模糊鉴定的情况下也能获得其准确浓度。
此外, 由于这种方法可同时获得代谢物的定性和定量信息, 分析人员就能以浓度为变量, 采用统计学对数据进行分析, 而传统的方法都是以积分面积为变量进行分析。
代谢物浓度代表了机体的状态, 因此以浓度为变量进行数据分析, 更利于生物标志物的发现以及相关代谢途径的阐述[12, 13]。
这种分析方法也存在一些缺点, 首先, 这种分析方法不像传统江春迎等: 基于核磁共振技术的定量代谢组学研究·951·方法, 可在一定程度上实现自动化, 而是需对样品中可定性和定量分析的物质进行一一比对, 由于样品中物质种类繁多, 分析起来就费时费力; 其次, 由于有些物质重叠较严重, 无法进行鉴定, 还需要采用加样法来辅助分析; 此外, 对于那些含量较低及重叠较严重的物质, 往往会带来较大的分析误差。
这些缺点限制了其广泛应用。
但随着数据库的日渐完善及算法的改进, 其对化合物的鉴定能力也会渐渐提高, 这些缺点将会得以改善。