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代谢组学技术概述


1 代谢组学分析实验设计及样品制备
代谢组学是一种大规模研究技术 , 对 于研究外源性物质 ( 药物或毒物 ) 刺激、 环境变化或遗传修饰引起的机体所有代 谢物变化过程是很有效的 , 比如寻找疾 病生物标志物用于早期诊断。但对于研 究特定种类的代谢物 , 这种大规模研究 平台的灵敏度则不如传统的技术手段。
2 代谢组学化学分析技术
代谢组研究需要比较复杂的分离、鉴定方 法, 到目前为止, 应用的方法主要包括核磁共振 (nuclear magnetic resonance,NMR)、电喷雾 电 离 质 谱 (electrosprary ionization mass spectrometry, ESI-MS) 、液相色谱 - 紫外光谱 质谱联用(liquid chromatography ultraviolet massspectrometry, LC-UV-MS) 、 串 联 质 谱 (tandem massspectrometry, tandem MS)以及液 相色谱-质谱联用(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)等。
核磁共振仪器组
早期核磁共振主要用于对核结构和 性质的研究,如测量核磁矩、电四极距、 及核自旋等,后来广泛应用于分子组成 和结构分析,生物组织与活体组织分析, 病理分析和结 构分析有精度高、对样品限制少、不破 坏样品等优点。
对于孤立的氢原子核(也就是质子),当 磁场为 1.4T 时,共振频率为 59.6MHz ,相应的 电磁波为波长 5 米的无线电波。但在化合物分 子中,这个共振频率还与氢核所处的化学环境 有关,处在不同化学环境中的氢核有不同的共 振频率,称为化学位移。这是由核外电子云对 磁场的屏蔽作用、诱导效应、共厄效应等原因 引起的。同时由于分子间各原子的相互作用, 还会产生自旋 - 耦合裂分。利用化学位移与裂 分数目,就可以推测化合物尤其是有机物的分 子结构。这就是核磁共振的波谱分析。
HPLC图谱
Liquid chromatography-mass spectrometry
气相色谱 gas chromatography
气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱 法。由于样品在气相中传递速度快,因此样品 组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平 衡。另外加上可选作固定相的物质很多,因此 气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的 分离分析方法。近年来采用高灵敏选择性检测 器,使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广 等优点。
第一台质谱仪是英国科学家弗朗西 斯 · 阿斯顿于 1919 年制成的。出手不凡,阿 斯顿用这台装置发现了多种元素同位素,研 究了 53 个非放射性元素,发现了天然存在的 287 种核素中的 212 种,第一次证明原子质量 亏损。他为此 荣获1922年诺贝尔化学奖。
质谱仪种类非常多,工作原理和应用范围 也有很大的不同。从应用角度,质谱仪可以分 为下面几类: 有机质谱仪: ① 气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) ② 液相色谱-质谱联用仪(LC-MS) ③ 其它有机质谱仪,主要有:基质辅助激光 解吸飞行时间质谱仪( MALDI-TOFMS ),富立 叶变换质谱仪(FT-MS) 无机质谱仪: ① 火花源双聚焦质谱仪 ( SSMS ) ② 感应耦合等离子体质谱仪(ICP-MS) ③ 二次离子质谱仪(SIMS)
ATRP 聚酯大分子引发剂的300M核磁共振氢谱
核磁共振波谱查询数据库
系统数据库包含化合物核磁共振氢谱 6 万多张,核磁共振碳谱 4 万多张.可通 过光谱编号、原子数、分子式进行查询, 结果得到所要查询化合物的有关信息及 其标准谱图.系统程序还允许用户将本 研究领域一些常用化合物的标准谱信息 和图谱添加进数据库以供日后查询.
1946年,美国哈佛大学的珀塞尔和斯坦 福大学的布洛赫宣布,他们发现了核磁共振。 两人因此获得了1952年诺贝尔奖。核磁共振 是原子核的磁矩在恒定磁场和高频磁场(处 在无线电波波段)同时作用下,当满足一定 条件时,会产生共振吸收现象。核磁共振很 快成为一种探索、研究物质微观结构和性质 的高新技术。目前,核磁共振已在物理、化 学、材料科学、生命科学和医学等领域中得 到了广泛应用。
乙氧氟草醚GC-MS质谱图
采用何种分析技术主要取决于待分析生 物系统的种类以及要解决何种科学问题。NMR 可以快速、无损伤性地进行代谢物的体内 (in vivo)或体外(in vitro)比较分析。直接应用 MS 进行代谢物分析虽然速度也较快 , 但具有 灵敏度以及分辨率较低的缺点。将 MS 与 GC 或 LC联用 (GC-MS 或LC-MS), 虽然降低了分析速 度 , 但却提高了分析灵敏度以及分辨率。而 且基于质谱的分析技术已长期用于代谢物指 纹图谱分析,具有比较成熟的样品制备、数据 采集以及分析等操作程序。
代谢组学分析可以指示细胞、组织或器 官的生化状态, 协助阐释新基因或未知功能 基因的功能, 并且可以揭示生物各代谢网络 间的关联性, 帮助人们更系统地认识生物体。 进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学 以及化学统计学三大方面的专业知识。 代 谢物化学分析技术及数据分析技术的发展极 大促进了诸多生物、医学问题的研究, 这些 知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、 药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极 为重要的作用。
基质辅助激光解吸附飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)
傅立叶变换离子回旋共振质谱仪
A FT-ICR mass spectrometer
质谱仪的基本结构及工作流程
单聚焦质谱仪示意图
氰戊菊酯的结构及其质谱图
近来, 两种新质谱技术傅立叶变换回旋共 振 质 谱 (Fourier transform ion cyclotron resonancemass spectrometry, FTICR-MS) 和 毛细管电泳质谱 (capillary electrophoresis mass spectrometry, CE-MS) 被用于代谢物图 谱分析。 FTICR-MS 具有高通量的优点 , 可检 测上千种代谢物, 但不能区分异构体限制了它 的应用; CE-MS 检测灵敏度较高 , 可以检测低 丰度代谢物 , Soga 等利用 CE-MS 在枯草芽孢 杆菌 (Bacillus subtilis) 中检测到一千多种 代谢物。
代谢组学技术
及其在医学研究中的应用
系 统 生 物 学 ( systems biology ) 是研究一个生物系统中 所有组成成分(基因、mRNA、蛋白 质等)的构成,以及在特定条件下 这些组分间的相互关系的学科。
在后基因组(post-genome)时代, 系统生物学研究逐渐成为人们关注 的焦点。系统生物学研究的目的是 根据细胞内基因、蛋白质、代谢物 以及细胞器等组分间的时空相互关 系构建生物网络, 了解生物行为。
最早的核磁共振成像实验是由1973年劳 特伯发表的,并立刻引起了广泛重视,短短 10年间就进入了临床应用阶段。人体组织中 由于存在大量水和碳氢化合物而含有大量的 氢核,一般用氢核得到的信号比其他核大 1000倍以上。正常组织与病变组织的电压信 号不同,结合CT技术,即电子计算机断层扫 描技术,可以得到人体组织的任意断面图像, 尤其对软组织的病变诊断,更显示了它的优 点,而且对病变部位非常敏感,图像也很清 晰。
质谱分析(mass spectrometry, MS) 是一种测量离子荷质比(电荷-质量比, charge-mass ratio)的分析方法,其 基本原理是使试样中各组分在离子源中发 生电离,生成不同荷质比的带正电荷的离 子,经加速电场的作用,形成离子束,进 入质量分析器。在质量分析器中,再利用 电场和磁场使发生相反的速度色散,将它 们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质 量。
一些组学研究技术的发展极大地推动了系 统 生 物 学 的 研 究 , 比 如 转 录 组 学 ( transcriptomics ) 、 蛋 白 质 组 学 ( proteomics ) 等 功 能 基 因 组 学 ( functional genomics,与结构基因组学structural genomics 相对 )研究方法可同时检测药物、疾病、环境或 其它因素影响下大量基因或蛋白质的表达变化情 况, 但这些变化往往不能与生物学功能的变化建 立 直 接 联 系 。 代 谢 组 学 (metabonomics / metabolomics) 方法则可为代谢物含量变化与生 物表型变化建立直接相关性。
代谢组 (metabolome) 是指一个细胞、 组织或器官中所有代谢物的集合 , 包含 一系列不同化学型的分子 , 比如肽、碳 水化合物、脂类、核酸以及异源物质的 催化产物等。代谢组学(metabonomics/ metabolomics) 来源于代谢组一词 , 是研 究一个细胞、组织或器官中所有小分子 代谢组分集合的科学。代谢组学研究的 目的是定量分析一个生物系统内所有代 谢物的含量。
质谱谱图数据库收录了大 部分常用化合物的质谱数据, 检索途径为质荷比检索,丰度 检索以及组合检索,可获取化 合物质谱谱图,物化性质等信 息。
高效液相层析
High performance liquid chromatography
70年代新发展的层析法。其特点是:用高压输液泵, 压强最高可达34个标准大气压。用直径约3~10微米的超 细支持物装填均匀的不锈钢柱。这种支持物能承受很高 的压力,化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC,可 做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微 -10 量化可达10 克水平。但用于制备,可以纯化上克的样 品。展层时间短,一般需几分钟到10余分钟。其分析速 度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥 发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质,两者 互为补充,都是目前最为理想的层析法。HPLC在生物化 学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。
进行代谢组分析 , 首先需要进行样品的 提取。对于组织和细胞培养液 , 水相和有机 相代谢物可以很容易地被提取。实际上 , 不 论各种代谢物在体内参与何种代谢过程 , 通 过相应抽提程序 , 所有的胞浆以及膜代谢物 均会被提取出来。样品制备过程的不一致性 导致结果重复性较差。因此 , 为最大程度减 小操作对代谢组数据产出的影响 , 人们应严 格 遵 循 一 套 标 准 的 提 取 程 序 (Standard Operating Protocols, SOPs)。
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