酪氨酸酶的提取催化活性及生物电化学传感器的构建与应用顾新 0909401008苏州大学材料与化学化工学部 09级化学类摘要：通过测定在不同浓度酪氨酸酶的作用下多巴红的生成速率测定酶的活性。
用加入Na2EDTA观察抑制剂对酶活性的影响。
酶电极的制作以及对酚的测定。
结果表明：加入抑制剂后酶的催化活性降低。
在邻苯二酚加入的瞬间有明显的峰电流产生，说明酪氨酸酶促进酚的氧化。
关键词：酪氨酸酶多巴红酶电极电化学传感器Abstract:Measuring the enzymatic activity through measuring the produce rate under different density of tyrosinase .Adding the Na2EDTA to the liquor and observing the effect. Making the enzymatic electrode pole and measuring the effect to the phenol. The results showed that tyrosinase promote the oxidation of phenol.Key words:tyrosinase dopamine red enzyme electrode electrochemical sensor1、前言生物体内由于生物催化剂酶的存在许多复杂化学反应可以在温和条件下进行得十分顺利和迅速，且酶催化反应具有高效性，选择性，反应条件温和等特性。
生物传感器是利用生物物质作为识别元件，将被测物质的浓度与可测量的电信号关联起来，其中研究最多的是酶传感器。
生物电化学传感器的构建主要包括酶，碳纳米管的应用。
生物传感器具有不需样品处理操作简便，体积小可实现连续在线监测等特点。
本实验通过土豆提取酪氨酸酶，并测定其活性，并将酶进一步固定于电极表面，制成酶电极，可用于酚的测定。
2、实验部分2.1仪器和药品仪器：分光光度计；离心机；粉碎机；超声波清洗器；铂电极；饱和甘汞电极；玻碳电极药品：L-多巴；磷酸氢二钠；氢氧化钠；盐酸；Na2EDTA；盐酸；多壁碳纳米管；酚材料：土豆2.2实验步骤2.2.1 酶的提取12.5g经过冰冻切碎的土豆，加入冰冷的25mL磷酸缓冲溶液（pH=7.0）,用粉碎机粉碎均匀。
倒出提取液，立即离心分离。
倾出上层清夜保存于冰箱。
提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。
2.2.2酶的活性测量取0.4mL土豆提取液，加2.6mL pH=7.0的缓冲液。
加2mL0.010mol/L的多巴溶液，摇匀。
反应约10min后，使用比色皿中，加入m的比色皿，使用自动扫描分光光度计扫描获取多巴红得吸收光谱。
并可从混合开始以时间间隔1min进行连续扫描，观察吸光度随时间增加的现象。
取2.5mL提取液用pH=7.0的缓冲溶液稀释至10mL,摇匀。
取0.1mL稀释过的提取液于2.9mL pH=6.0的缓冲液，再加2mL多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在475nm处测定吸光度。
开始6min内每分钟读1个数，以后隔2min读1个数，直至吸光度变化不大为止。
取0.2mL、0.3mL、0.4mL已稀释过的提取液重复上述实验，（注意总体积为5mL，每次换溶液洗比色皿只能倒很少量溶液洗1次）。
以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。
2.2.3抑制剂的影响取0.4mL稀释过的提取液，加入少量固体NaEDTA振动混合，反应一段时间后，配成测2定溶液观察现象。
并按上述实验方法，测定酶的活性，并对实验结果进行对比。
1.2.4酶电极以及样品中酚的测定将酶电极置于0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）中，电磁搅拌溶液，在极化电位-0.1V下记录电流-时间曲线，待基本电流稳定后，多次加入一定量的酚溶液，并观察所得曲线。
2.2.4酶电极的制备将玻碳电极用3000目的进口细砂纸湿磨抛光，然后依次用稀HCl，无水乙醇，去离子水清洗各3min，干燥后备用。
取6μL碳纳米管悬浊液滴加于预处理后的玻碳电极表面，红外灯烘干，再取一定量的酪氨酸酶溶液滴在电极表面，室温下放置干燥3h即可。
酶电极不使用时可存放于冰箱中。
2.2.5样品中酚的测定将酶电极置于0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）中，电磁搅拌溶液，在极化电位-0.1V下记录电流-时间（i-t）曲线，待基本电流稳定后，多次加入一定量的标准酚溶液，以电流增量对酚的浓度作工作曲线。
3.结果和讨论3.1吸光度随时间的变化表1 不同时间吸光度的变化时间吸光度1 2 3 4 5 6 7 8 91011 0.611 0.659 0710 0.733 0.743 0.752 0.747 0.733 0.733 0.733图1吸光度随时间的变化由图可得，吸光度随时间变化先变大后变小然后趋于平台。
先变大是因为反应逐渐进行多巴红浓度逐渐变大，最大后反应完全，然后逆反应，到达平台时反应平衡。
3.2最大吸收波长的测定表2 不同波长处的吸光度波长/nm 吸光度A400 410 420 430 440 450 455 460 465 470 475 480 485 490 500 0.734 0.734 0.746 0.755 0.753 0.762 0.765 0.766 0.768 0.779 0.791 0.786 0.784 0.776 0.767510 520 530 540 550 560 570 580 590 6000.753 0.722 0.692 0.656 0.629 0.583 0.572 0.561 0.5790.565图2不同波长下多巴红的吸光度由图2可以得出多巴红在475nm 波长处有最大吸收。
3.3酪氨酸酶的活性测量加入不同浓度酪氨酸酶时溶液吸光度随时间的变化情况的记录，并以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。
表3 不同浓度酪氨酸酶时溶液吸光度随时间的变化时间t/min 加入0.1mL 释后提取液加入0.2mL 释后提取液 加入0.3mL释后提取液 加入0.4mL 释后提取液 0.4mL 释后提取液加抑制剂 10.026 0.057 0.083 0.110 0.109 2 0.038 0.061 0.089 0.116 0.123 3 0.047 0.072 0.103 0.135 0.136 4 0.052 0.076 0.114 0.151 0.147 50.0540.0790.1200.1630.1516 0.056 0082 0.124 0.170 0.1568 0.059 0.083 0.127 0.176 0.15810 0.060 0.083 0.129 0.180 0.16012 0.061 0.083 0.129 0.181 0.16114 0.062 0083 0.129 0.182 0.16216 0.062 0.18318 0.062图3加入0.1ml酪氨酸酶时溶液吸光度随时间的变化由图可知加入0.1mL稀释后的提取液时，产物的生成速率v=0.0021图4加入0.2ml酪氨酸酶时溶液吸光度随时间的变化=0.008由图可知加入0.2mL稀释后的提取液时，产物的生成速率v2图5加入0.3ml 酪氨酸酶时溶液吸光度随时间的变化由图可知加入0.3mL 稀释后的提取液时，产物的生成速率v 3=0.01图6加入0.4ml 酪氨酸酶时溶液吸光度随时间的变化由图可知加入0.4mL 稀释后的提取液时，产物的生成速率v 4=0.013图7加入0.4ml酪氨酸酶和抑制剂时溶液吸光度随时间的变化根据米氏方程 ,以1/vi 对1/[S]作图，由直线斜率和截距可求得km值。
由图可知加入0.4mL稀释后的提取液以及抑制剂时，产物的生成速率v1=0.014，说明加入抑制剂后反应速率明显降低，抑制剂降低了酶的活性。
3.4反应速率与酶浓度的关系表4 反应速率与酶浓度的关系v 1/v [S] 1/[S]0.004 0.008 0.010 0.013 250125100770.10.20.30.41053.32.5对1/vi 对1/[S]作图得图7反应速率与酶浓度的关系直线方程为1/v i =k m /(v max [S])+1/v max ，即1/v max =19.08，v max =0.0524, k m /v max =22.87，所以k m =1.20mol ·L -1. 3.5酚对酪氨酸酶的影响图8酚对酪氨酸酶的影响4.参考文献(1).卞国庆，纪顺俊.综合化学实验[M].苏州：苏州大学出版社，2007(2).王尊本主编.综合化学实验[M].北京：科学出版社，2003:161~166.(3).浙江大学，南京大学，北京大学，兰州大学主编. 综合化学实验[M].北京：高等教育出版社，2001：p183~187.(4).古练权主编.生物化学[M].北京高等教育出版社，2000.(5).Zhao Q ，Guan L H ,Gu Z N,Zhuang Q K.Determination of Phenolic Compounds Basedon the Tyrosinase-Single Walled Carbon NanotubesSensor[J].Electroanalysis,2005(17):85~90.。