M ycosystema菌 物 学 报 15 November 2009, 28(6): 895-901jwxt@ISSN1672-6472 CN11-5180Q©2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.*Corresponding author. E-mail: fanli@收稿日期: 2008-10-24, 接受日期: 2009-01-12兰科植物与真菌共生关系研究方法及其应用姜鹏 范黎*首都师范大学生命科学学院 北京 100048The application of research methods in the symbiosis between orchids and fungiJIANG Peng FAN Li *College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China兰科Orchidaceae 是一个广布于全球的植物大科，包括了许多著名的药用植物和珍贵花卉。

因其有较高的商业价值，植物学家和园艺工作者等从各个角度对兰科植物进行了研究。

Bernard 首次发现兰科植物种子需依赖真菌的侵染才能萌发（Curtis 1939）。

此后，有关兰科植物与真菌共生关系的研究广泛地开展起来，研究者们从二者间的专一性、营养、生理以及共生关系形成的机制等不同角度进行研究并取得了许多成果。

在此过程中，很多不同的研究方法被研究者们应用到自己的研究中，本文介绍了其中一些主要的方法。

1 分子系统学理论与方法1.1共生真菌的分类鉴定兰科植物共生真菌的早期研究中，一般采用传统的形态学分类方法对其进行鉴定，存在一定的局限性，因为形态学方法中所采信的鉴别特征多是真菌的繁殖结构或有性世代的特征，而很多兰科植物共生真菌的此类结构特征在人工培养条件下常难以甚至不可能获得。

例如丝核菌属Rhizoctonia 的成员是兰科植物共生真菌的主要类群之一，但研究者们没有发现它们的无性繁殖结构，也很少甚至没有获得其有性世代，只能凭借营养菌丝和菌落的培养特征以及融合群等对其菌株进行区分。

笔者在研究促进天麻Gastrodia elata 种子萌发的共生真菌时发现，绝大多数的种子共生萌发真菌在人工培养条件下不产生子实体，因而不能采用形态学方法对其进行鉴定。

随着分子生物学技术的发展，许多真菌种的基因序列被测定，一些适用于分类学以及系统学研究的基因陆续被选出，这一切都为分子系统学研究奠定了基础，分子系统学的理论和方法陆续被研究者们运用到兰科植物共生真菌的研究当中。

按照系统学的理论，一般亲缘关系较近的物种在系统发育树上的距离也比较接近。

研究者可以选择不同的基因来构建未知共生真菌和相关已知真菌的分子系统发育树，并通过分析未知共生真菌在系统发育DOI:10.13346/j.mycosystema.2009.06.023树上所处位置判断该真菌分类学地位及其所属的种类。

虽然系统发育种（phylogenetic species）不能直接对应于形态种（morphological species），但研究者可以根据所掌握的资料和实际情况来做出分析。

Ma et al.（2003）基于ITS（internal transcribed spacer）片段的分子系统学分析结果，将从新加坡的一些兰科植物中分离到的24株瘤菌根菌属Epulorhiza的菌株鉴定为 E. repens和 E. calendulina-like Rhizoctonia。

Sekizaki et al.（2008）根据IGS-1（intergenic spacer 1）片段系统学分析结果，将从产自日本北海道的成年天麻中分离到的一种共生真菌鉴定为Armillaria nabsnona，这是首次发现A. nabsnona可以与天麻形成共生关系。

至此，在日本共有7个蜜环菌属Armillaria的种可与成年阶段的天麻共生（Cha & Igarashi 1996）。

A. nabsnona 是北半球常见种，但在中国还未见记载，孙立夫等（2007）按其在北半球的分布情况推测，中国也应有其存在。

但由于缺乏有关天麻成年阶段共生真菌多样性和专一性的研究，目前在我国仅知道 A. mellea是天麻成年阶段的共生真菌。

1.2 兰科植物与共生真菌间的专一性随着兰科植物共生真菌被大量发现，兰科植物与其共生真菌之间的专一性对应关系被研究者们所认识，但某些共生真菌的分类学地位采用形态学方法难以界定，给二者之间专一性研究带来了困难。

近年来，许多研究者将分子系统学理论引入了兰科植物与其共生真菌专一性关系的研究之中。

Taylor et al.（2002）在其文章中提出这样一个理论：无论从一种兰科植物中发现多少种共生真菌，当所有这些被发现的真菌都属于同一系统学分支时，那么这种兰科植物与这些处在同一个系统学分支上的共生真菌之间就存在专一性，因为处在其他系统学分支上的真菌不能与这种兰科植物形成共生关系。

他们发现头蕊兰属的Cephalanthera austinae仅与革菌科Thelephoraceae下的一些成员建立共生关系，珊瑚兰属的Corallorhiza maculata和 C. mertensiana仅与红菇科Russulaceae的成员建立共生关系（Taylor & Bruns 1997，1999）。

Shefferson et al.（2005）对杓兰属Cypripedium七种兰花的共生真菌nrLSU、ITS、mtLSU三个基因进行了系统学分析，发现杓兰属的种与其共生真菌之间有很高的专一性，其共生真菌都聚在胶膜菌科Tulasnellaceae 下很窄的几个分支中。

1.3兰科植物共生真菌生态学研究早期的研究者Curtis（1939）发现，相同生境下的不同兰花种有相似的内生真菌，而不同生境下的同一兰花种有不同的内生真菌。

此后有关兰科植物共生真菌生态学的研究工作逐渐展开（Hadely 1975；Harvais & Hadley 1967；Harley & Smith 1983）。

Harley & Smith（1983）提出在某一生态条件下生活习性相关的某些种的兰花和某些种真菌以生态群（ecological group）的形式存在，但一些共生真菌的分类地位难以依靠形态学方法界定。

近年来，分子系统学方法被应用于兰科植物共生真菌生态学的研究。

Otero et al.（2004）对从兰科植物Ionopsis utricularioide和Tolumnia variegata中分离到的角担菌属Ceratobasidium共生真菌菌株进行了分子系统学研究，发现这些菌株属于4个不同的系统学分支，其中一个分支的真菌在同一地点的I. utricularioide和T. variegata中都以较高的频率出现；不同地区的T. variegata的菌根真菌在这四个分支中所占的比例很不相同，生长在哥斯达黎加Tortuguero森林公园的T. variegata的共生真菌在四个分支中所占的比例接近，生长在波多黎各Dorado 地区的T. variegata的共生真菌仅出现在其中的两个分支中。

这些共生真菌都是丝核菌状（Rhizoctonia-like）真菌，形态学鉴定困难，在形态学鉴定的基础上进行共生真菌在兰花中的分布及两者间的关系的分析几乎不可能，而采用分子系统学研究方法则很好地解决了这一问题，虽然这些真菌没有被鉴定到种，但通过聚类分析也达到了同样的研究目的。

Ogura-Tsujita & Yukawa（2008）对从不同生境下的Epipactis helleborine中分离到的难以用形态学方法鉴定的共生真菌进行了分子系统学分析，发现生长在海边沙丘森林中的 E. helleborine的共生真菌主要是Wilcoxina属的成员，而生长在内陆森林中的E. helleborine的共生真菌则主要是Tuber、Hydnotrya、Exophiala等属的成员。

虽然分子系统学理论和方法目前已经被广泛应用于兰科植物与其共生真菌之间关系的研究，然而，可用的已知真菌种类的序列信息和分子系统学研究资料不足以成为制约该领域研究深入的最大因素。

已有的真菌的序列资料和分子系统学研究资料相对于数量庞大、种类繁多的兰科植物共生真菌来说是远远不够的，经常有研究者找不到与自己所研究的共生真菌序列相近的已知真菌，这给有关的研究带来了一些困难。

2 共生培养试验2.1共生真菌鉴别和优良菌株筛选从兰科植物中发现的真菌不一定都是其共生真菌，研究者们主要采用兰科植物与真菌的共生培养试验来判断其是否为共生真菌。

共生培养试验包括两类，一类是兰科植物种子与真菌的共生萌发试验，另一类是兰科植物在其种子萌发后的生长阶段与真菌的共生培养试验。

共生培养试验也被研究者们用来筛选对兰科植物种子萌发和生长具有良好促进效果的共生真菌菌株，为人工培育兰科植物提供优质菌株。

我国学者徐锦堂的团队曾对其分离到的天麻种子共生萌发真菌进行了共生萌发试验，通过比较，筛选出一株具有很高活性的菌株用于天麻的人工有性繁殖（冉砚珠和徐锦堂 1990）。

Porras-Alfaro & Bayman（2007）在用这两类共生试验对从香荚兰属Vanilla植物中分离到的一些真菌进行研究时发现了可用于香荚兰属植物人工培育的高效菌株，分子系统学研究表明这些菌株都聚在角担菌属Ceratobasidium下的一个分支。

2.2 寻找潜在的兰科植物共生真菌Warcup（1973）利用10个来自不同种兰科植物的丝核菌属Rhizoctonia的菌株与10种兰科植物种子进行共生萌发试验以验证二者间的专一性时发现，某些种兰科植物种子可以与其他种兰科植物的共生真菌形成共生关系而萌发。

研究者们认为对兰科植物潜在的共生真菌的利用将能扩大兰科植物继续生存的机会，他们用共生培养试验来寻找潜在的共生真菌。

Perkins et al.（1995）发现葱叶兰Microtis parviflora的种子可与七种从未在该植物中发现的真菌共生而萌发，而在这之前仅发现 E. repens和瘤菌根菌属Epulorhiza的一株未定种真菌与该种植物形成菌根关系。

徐锦堂等（2001）对从45种兰科植物中分离到的132个菌株与天麻种子进行了共生萌发试验，发现了3个高效菌株，并推广到天麻的人工有性繁殖生产。

Porras-Alfaro & Bayman（2007）研究发现从I. utricularioide中分离到的一类角担菌属Ceratobasidium菌株对香荚兰属Vanilla植物的种子萌发有很好的效果，但未鉴定这些菌株到种。