乙肝疫苗的制备
乙肝疫苗的概念

乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗 接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体， 这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一 旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止 感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了 预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染 的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染 的最有效方法。


主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取和柱式胶回收试剂盒 乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 DMEM 和透析胎牛血清 胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体 Lipofectamine TM HBsAg 血凝检测试剂盒
主要试剂
限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取和柱式胶回收试剂盒 乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 DMEM 和透析胎牛血清 胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂质体 Lipofectamine TM HBsAg 血凝检测试剂盒
分离纯化的流程
疏水柱层析 阴离子交换层析 凝胶过滤层析

1、发酵液的预处理 连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩 2、疏水柱层析 介质： Butyl S Sepharose FF 加入适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡 液电导率相等 按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降 低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析

基因工程乙肝疫苗是采用基因工 程技术生产的，即构建含有乙肝 表面抗原基因的重组质粒，然后 转染相应的宿主细胞，如酵母、 CHO细胞，生产乙肝表面抗原蛋 白。利用重组酵母生产的叫重组 酵母乙肝疫苗，利用CHO细胞生 产的叫重组CHO乙肝疫苗，剂量 为每支5微克。它们都可以用于 预防所有已知亚型的乙肝病毒感， 都可以放心选用。
3、阴离子交换柱层析 介质：DEAE Sepharose FF HBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐 换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和 IEC平衡液一致 按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯 度分段洗脱、清柱再生程序层析
4、凝胶过滤柱层析 介质：Sepharose 4 FF 超滤浓缩到适当体积 按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析 5、除菌 收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品
乙肝疫苗的制造工艺
1.目的基因的获取 2.工程菌的构建 3.目的基因的表达 4. 蛋白质的分离纯化

目的基因的获取
编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取 一般目的基因的获取方法有: cDNA法, 化学合成法 ,反转录法
工程菌的选择


CHO细胞的特点
①具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药 物蛋白在分子结构、理 化特性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子 ②具有产物胞外分泌功能 ,便于下游产物分离纯化; ③具有重组基因的高效 扩增和表达能力; ④具有贴壁生长特性 ,且有较高的 耐受剪切力和渗透压能力 ,可以进行悬 浮培养 ,表达 水平较高; ⑤CHO 细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的内源蛋白 ,利 于外源蛋白的后分离
年，为了得到乙肝疫苗，研究 人员从研究复试病毒，到酵母，并研究纯化的蛋白 质序列。并经过了大量的诱导免疫反应。 1991年，疫苗被应用于高危险人群。主要是一些儿 童，因为儿童的感染率极高。 2005年，美国推行常规的疫苗注射。给所有未注射 过乙肝疫苗的儿童注射。治疗性疫苗是指在已感染 病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导 特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天 然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品

基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（HbsAg）亚单 位疫苗，它系采用现代生物技术将乙肝病毒表达表 面抗原的基因进行质粒构建，克隆进入啤酒酵母菌 或CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中，通过培养这 种重组酵母菌或CHO细胞来表达乙肝表面抗原亚单 位。发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅 胶吸附、洗脱等工序，再经过疏水层析，可使产品 抗原蛋白纯度达99%以上。
编码乙型肝炎表面抗原的基因
PCR扩增
目的基因
提质粒与表达载体连接
与克隆载体连接，转化
转入CHO细胞中表达
蛋白质的分离纯化
固液分离 离心沉淀 膜过滤 双水相萃取 浓缩与初步纯化 离子交换层析 疏水层析 亲和层 析 高度纯化 DNA的去除 热原质的去除 病毒的去除
分离纯化的基本要求 技术条件温和，保持其生物活性 选择性好，达到有效分离纯化的目的 技术间可以直接连接，节省工艺步骤 收率高，过程快 选择分离纯化方法的依据 根据产物表达形式来选择 根据分离单元之间的衔接来选择 根据分离纯化工艺的要求来选择
乙肝疫苗的制备

目前使用的乙肝疫苗是基因工程 疫苗--重组酵母乙肝疫苗和重组 CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙 肝病毒的表面抗原，即一种乙肝 病毒外衣壳蛋白，并非完整病毒。 这种表面抗原不含有病毒遗传物 质，不具备感染性和致病性，但 保留了免疫原性，即刺激机体产 生保护性抗体的能力。乙肝表面 抗原曾经是从乙肝病毒携带着的 血液，经纯化灭活等严格工序制 备而来，即血源性疫苗，该疫苗 由于安全、来源和成本等原因已 被淘汰(如，有引起血源性疾病的 嫌疑和浪费大量的血