第八单元细菌检验基础知识8.1 细菌的分类微生物的种类按其结构、组成等差异，分为非细胞型微生物、原核细胞型微生物、真核细胞型微生物等三类。

（细菌属于原核细胞型微生物）细菌经典的传统分类法，按界、门、纲、目、科、属、种、型、株。

8.2 细菌的形态学及形态学检查法细菌形态与结构主要指细菌的大小、形状、排列及超微结构。

细菌的结构与其生理功能、致病性、免疫性有关。

8.2.1 细菌的形态与结构1 细菌的基本形态球菌、杆菌、螺旋菌。

（杆菌是最常见的形态）2 细菌的大小测量细菌大小的单位：微米（μm）；球菌以直径表示大小；杆菌以长与宽表示大小。

菌龄与细菌大小的关系受许多因素影响，主要与代谢废物的积累及培养基中渗透压上升等因素有关。

3 细菌的结构基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质。

特殊结构：鞭毛、菌毛、荚膜、芽孢等。

8.2.2 细菌形态学检查法分为不染色标本检查法和染色标本检查法。

不染色标本检查法：主要用于观察细菌的动力。

染色标本检验法：主要用于观察细菌的形态、大小、排列及荚膜、鞭毛、芽孢等。

细菌学中最常用的鉴别染色法是革兰氏染色法。

同一科的细菌革兰氏染色反应相同，如芽孢杆菌科细菌全是G+，肠杆菌科细菌全是G-。

大多数病原性球菌属于G+，大多数病原性杆菌属于G-，病原性弧菌是G-。

8.3 细菌的生理学研究细菌的营养、代谢、生长繁殖等生理活动规律及其外界环境的相互关系。

8.3.1 细菌的主要理化性状1 细菌的化学组成主要包括水、蛋白质、糖类、脂类、无机盐、核酸和维生素等。

（1）水分：占细菌质量75%-85%，芽孢约40%，细菌繁殖体内主要是游离水，芽孢内主要是结合水。

（2）固形成分：占菌体质量15%-25%，有蛋白质、核酸、糖类、脂类和无机盐类等。

在固形成分中，碳、氢、氧、氮四种元素占90%-97%，其他元素占3%-10%。

2 细菌的物理性状（1）带电现象：G+等电点低，均为pI 2-3；G-等电点高，约为pI 4-5。

（2）多相胶体：细菌原生质中具有多种蛋白质，其成分结构各不相同，为多相胶体。

（3）表面积大：有利于细菌吸收营养和排泄代谢产物，因而细菌代谢活跃，繁殖速度很快。

（4）布朗运动：无鞭毛的细菌在溶液中，因受到分散酶分子的撞击，发生不移动位臵的颤动，叫做布朗运动。

（5）细菌的光学性质：细菌菌体呈半透明状态，光线照射菌体时，一部分光被吸收，一部分光发生散射，所以细菌悬液呈现混浊现象。

（6）渗透性：细菌的细胞壁和细胞膜都有半渗透性，可允许水分透过，但对其他物质则有选择性的通透作用。

8.3.2 细菌的代谢和生化反应细菌为了生长繁殖，必须从环境中吸取营养物质作为能源和基本原料，并排出不需要的产物，这些生化过程称为细菌的代谢，包括分解代谢和合成代谢。

细菌对各种基质的代谢过程称为细菌的生化反应。

1 细菌的分解代谢及其产物（1）细菌对糖类的分解代谢过程：多糖→单糖→丙酮酸。

（2）细菌对蛋白质的分解代谢过程：蛋白质→蛋白月示→蛋白胨→多肽→氨基酸。

2 细菌的合成代谢及其产物（1）毒素与侵袭性酶：细菌产生的内毒素和外毒素均有强烈毒性，尤以外毒素为甚。

内毒素（耐热）：为革兰氏阴性菌的细胞壁成分，即脂多糖，其毒性存在于脂类A部分，当菌体死亡崩解后才游离出来。

外毒素（不耐热）：是蛋白质，在细菌生活过程中即可释放出菌体。

产生外毒素的细菌大多是革兰氏阳性菌，但也有少数革兰氏阴性菌。

某些细菌还能产生具有侵袭性的酶，能损伤机体组织，如产气荚膜梭菌的卵磷脂酶、链球菌的透明质酸酶等。

（2）热原质（耐高温）：许多革兰氏阴性杆菌（变形杆菌、铜绿假单胞菌）及一些革兰氏阳性杆菌（枯草芽孢杆菌）能产生一种多糖，将它注入人体或动物体内能引起发热反应，故称热原质。

需在250℃经45min高温下干烤才能破坏。

（3）色素：有些细菌在一定条件下（氧气充足、温度适宜或暴露阳光）能产生各种颜色的色素。

产生的色素有的能溶于水而扩散至周围环境中（铜绿假单胞菌产生的绿色色素，可使培养基和菌落呈黄绿色到蓝绿色），另一些色素为脂溶性不溶于水仅使菌落本身有色（金黄色葡萄球菌仅使菌体本身有色）。

（4）抗生素：主要是由某些微生物在代谢过程中产生的一种抗生物质，能抑制或杀死某些生物细胞（主要是微生物和肿瘤细胞）。

抗生素主要由放线菌和真菌产生，由细菌产生的较少，只有多黏芽孢杆菌产生的一组多肽类抗生素（多黏菌素）和由地衣芽孢杆菌产生的多肽类抗生素（杆菌肽）等少数几种。

（5）细胞素：某些细菌种、株间产生的一类具有抗菌作用的蛋白质。

与抗生素不同，其抗菌范围狭窄，仅对产生与细胞素的菌株有近缘关系的细菌才有抑杀作用。

由于其具有特异性，已用于细菌种内的分型。

（6）维生素：是细菌必需的生长因子，有些细菌能自己合成，除供菌体本身所需外，也能分泌至菌体外。

人体肠道内的大肠埃希氏菌能合成维生素B6、B12、K2等，可供人体所需。

8.4 细菌的培养与分离技术8.4.1 细菌培养的用途1 细菌的鉴定和研究通过细菌培养可以研究细菌的形态、代谢活动、生化反应、抗原结构及致病力等，并且对细菌进行鉴定。

2 细菌学检验细菌培养应用于食品和环境等样品的细菌学检验，以评价食品或环境的卫生情况。

3 传染病的诊断与治疗对患者或带菌者体内（代谢物）的病原菌进行培养，鉴定其种属并对病原菌进行药物敏感性试验，从而作出确切的病原学诊断，选择有效药物进行治疗。

8.4.2 细菌培养所需的条件1 培养基按其用途可分为六大类：基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、特殊培养基和厌氧培养基。

2 细菌培养的其他条件（1）合适的酸碱度：大多数病原菌最适宜的酸碱度在pH7.2-7.6之间，个别细菌如霍乱弧菌可在碱性pH8.4-9.2环境中生长。

许多细菌在培养过程中因分解糖类而产酸，影响了本身的生长，因此有时需在培养基中加入磷酸氢二钠、磷酸氢二钾等缓冲剂，防止溶液pH值波动过大。

（2）适宜的温度：一般细菌在15-40℃都能生长，但多数病原菌的最适生长温度为37℃。

（3）一定的湿度：细菌生长需要一定的水分，以利于营养物质的渗透。

干燥不利于细菌的生长。

（4）必要的气体环境：需氧菌须在有氧环境下生长，厌氧菌须在无氧条件中才能生长。

牛布鲁氏菌及脑膜炎球菌初分离时，必须在培养环境的大气中增加5%-10%的CO2。

（还有微需氧菌和兼性厌氧菌）（5）无菌的培养基：对细菌需要的培养基进行灭菌，防止杂菌生长。

8.4.3 细菌培养法根据对氧气需求不同可分为需氧培养和厌氧培养。

根据培养基的物理状态不同分为液体培养、固体培养、半固体培养。

1 液体培养不同类型的细菌在液体培养基中会出现不同的生长现象。

（1）混浊：细菌向四周均匀扩散，出现肉眼可见的不同程度的均匀混浊生长。

（2）沉淀：少数排列成链状的细菌可呈沉淀式生长，沉淀物上面的液体清澈，如链球菌。

（3）菌膜：专性需氧菌多生长在液体表面，形成菌膜，如枯草杆菌。

2 固体培养将检材中的目标对象菌用人工培养法分离出来成为纯种，称为分离培养。

常用的分离方法有平板划线分离法和涂布法。

分离培养可使细菌在平板培养基表面生长。

如果接种的细菌能适当的分开，经一定时间培养后，便形成单一菌落。

菌落的大小、形状、色泽、边缘、透明度、湿润度、溶血现象等特点则因细菌的种类和所用培养基不同而异。

菌落的这些特征是识别细菌的重要依据。

当细菌在固体培养基表面密集生长时，多个菌落融合在一起，称为菌苔。

（斜面看菌苔）3 半固体培养细菌在半固体培养基中生长时，无鞭毛的细菌沿着穿刺线生长，有鞭毛的细菌，除了沿穿刺线生长外，还可看见从穿刺线向外扩散生长的趋势。

因此，以穿刺法将细菌接种于半固体培养基中有助于鉴别细菌是否具有动力，是否有鞭毛。

8.5 细菌的的生物化学试验利用生物化学的方法来检查这些代谢产物以鉴别细菌的方法称为细菌的生物化学试验，简称生化试验。

8.5.1 糖类代谢试验主要有糖（醇）类发酵试验、甲基红试验、V-P试验、ONPG试验、氧化发酵试验等方法。

1 糖（醇）类发酵试验（1）原理不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。

即使某些能发酵同样的糖（醇），但其产物也不同，有的产酸产气，有的产酸不产气，可根据这些特点来鉴别细菌。

（大肠埃希氏菌和产气杆菌都能分解葡萄糖、乳糖时产酸产气，而伤寒杆菌分解葡萄糖时只产酸不产气，且不能分解乳糖。

）（2）方法将纯培养的待检细菌，无菌操作接种到糖（醇）发酵培养基中，臵于37℃培养箱内，培养数小时到两周，观察结果。

若使用微量发酵管或要求培养时间较长时，应保持培养箱中一定的湿度，以免培养基干燥，影响细菌生长。

（3）结果被检细菌若能发酵培养基中的糖（醇）时，则产酸使培养基的pH值降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应；若发酵培养基中的糖（醇）产酸产气，则培养基不仅显酸性反应，并且有气体出现。

培养基若系固体或半固体，则培养基内有裂隙等现象。

培养基若为液体，可看到在培养基中的倒臵小玻管中有气泡。

并且气体占整个倒臵小玻管的10%以上，若被检细菌不分解培养基中的糖（醇），则培养基中除了细菌生长外，无任何其他变化。

（4）说明：糖（醇）发酵试验培养基，大致可分为液体、半固体、固体（两层、高层斜面）等几类。

糖（醇）发酵培养基的灭菌温度115℃，15min。

糖（醇）发酵试验用的各种糖（醇）发酵管含糖（醇）的浓度一般为0.5-1.0%，有时可达2.0%。

2 甲基红（methyl red）试验（简称MR试验）（1）原理大肠埃希氏菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH值降低到4.4以下，这时若加入甲基红指示剂，由于甲基红指示剂的变色范围是pH4.4（红色）-pH6.2（黄色），故培养液呈红色。

产气肠杆菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，但又很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物质，则培养液的pH值仍在6.2以上，故此时加入甲基红指示剂，培养液呈黄色。

（2）方法将被检细菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养2-4天，取出一部分培养液加甲基红指示剂数滴，观察培养基颜色。

（3）结果呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。

（阳性对照菌是大肠埃希氏菌、阴性对照菌是产气肠杆菌）3 V-P试验（Voges和Proskauer二氏创建，故称为伏-普试验）目的是检查细菌是否能分解葡萄糖，产生乙酰甲基甲醇。

（1）原理产气肠杆菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，再将丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇, 乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基结合,形成红色化合物,在培养基中加入含胍基化物如肌酸、肌酐等，可加速反应。

（2）方法将被检细菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养48h，取出后按每毫升培养物加0.1mL甲液（6%α-萘酚酒精溶液）和乙液（40%的KOH溶液），通常在10min内显色，若不显色，放臵于50℃水浴2h，呈现红色者为阳性，不显红色者为阴性。