管底部的速率不同。
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差速离心的方法

当离心力低，离心时间短时，细胞核即可沉到管底；


加大离心力后，又可分离出线粒体；
离心力再加大，才能分离出微粒体和核糖体。

最后几步的超离心力，可超过地心引力的10万倍以上，
悬液经离心分离出核糖体以后所剩的上清液，则是由
细胞原生质的可溶性部分和极微小的颗粒所组成，这
常速离心机
2) Fr ＝3000～5 000 中速离心机 高速离心机 超速离心机
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离心分离法根据其操作方式的不同，又可分为差 速离心和密度梯度离心。
1) 差速离心法
如果所要的蛋白质(或生物大分子)主要集中在某
一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶
性的细胞质等；
则可利用差速离心（differential centrifugation）

注意：每次得到的沉淀，必须经过几次 洗涤后，反复悬浮和离心，才能得到比
较纯的部分。
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差速离心图示
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差速离心的方法
为了将细胞中各种组分纯化分离，首先
要在等渗缓冲液中把细胞破碎匀浆;
然后用差速离心的方法，把匀浆液中的
各种组分分离;
在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心
同离心力，将各种亚细胞组分和各种 颗粒分别分开。
2) 不同物质有不同的形状、大小、质量
和密度，当在介质中离心时，它们的
沉降速度各有差异。
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大的颗粒碎片在低速时很快沉降，被
分离的物质留在上清液中;
逐步增加离心力，进一步离心上清液，
使中等颗粒沉降，
最后是大小和密度最小的颗粒沉降。
并形成区带，此即等密度梯度离心法。
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等密度梯度离心法
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三、离心过滤

1）离心过滤的原理
以离心力作为推动力完成过滤操作,
具有离心和过滤的双重作用。
2）影响离心过滤速度的因素
过滤面积和离心力
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离心过滤机可分离固体密度大于或 小于液体密度的悬浮液。
方法将它们分开收集，该细胞Fra bibliotek分作为下步纯化
的材料。
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优点：可以一下子除去很多杂蛋白质，使纯
化工作容易得多。
如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细 胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂 使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。
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差速离心法的原理
1) 差速离心是利用不同离心速度产生不
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离心沉降是利用惯性离心力和物质的沉降 系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、 浓缩或提取条件。
1）离心沉降的原理：
固体和液体之间存在一定的密度差，且 固体密度大于液体的密度。 2）影响离心沉降速度的因素 密度差、颗粒大小、液体粘度、离心力大小
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斯托克斯公式：

u=d2(ρs－ρ) rω2/18 μ
行离心，并控制离心分离的时间，使 得粒子完全沉降之前，在液体梯度中 移动而形成不连续的分离区带。
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一般密度梯度离心图示
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3) 等密度梯度离心法

等密度梯度离心法：不同粒子存在密度
差时，在离心力场作用下，粒子或向下 沉降，或向上浮起，一直移动到与它们
密度恰好相等的位置上（即等密度点）

可分为: 连续式离心机和间歇式离
心机。
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第二节 细胞破碎

细胞破碎：
指选用物理，化学，酶或机械的方
法来破坏细胞壁或细胞膜。
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一、细胞壁结构
细胞壁化学组成非常复杂, 取决于

微生物类型 细胞的年龄 细胞的生长生理学 多糖，脂质，蛋白质在三维结构上的排 列方式
1)密度差越大(ρs－ρ)，离心沉降速度越快； 2)固体颗粒尺寸越大，越容易离心;
3)液体粘度μ越大，越不容易离心；
4)离心力rω2的大小对固液分离影响很大。
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3） 离心机的分类
分离因数 Fr＝ rω2／g 分离因数 Fr 的大小分为

1) Fr＜3000 3) Fr ≥5000 4) Fr=2×104～106
泌到胞外;
也可用破碎细胞的方法使其释放出来。
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细胞与液体物质的分离又称为固液分离， 固液分离方法包括过滤与离心沉降。
一、过滤
指利用多孔性介质截流固体悬浮液中的 固体颗粒，进行固液分离的方法。
过滤不但是传统的化工单元，而且是 目前工业生产中用于分离细胞和不溶性物 质的主要方法。
些组分则需要更严格的离心方法才能分离出来
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2) 一般密度梯度离心法

也称分级区带离心，有：
1）蔗糖密度梯度离心
2）氯化铯密度梯度离心

用于RNA-DNA混合物、核蛋白体亚单
位和其他细胞成分的分离
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一般密度梯度离心法：把样品铺放在
一个连续的液体密度梯度上，然后进
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2）间接记数法
在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来
的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。
将破碎后的细胞悬液离心去掉固体（完整细
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细胞壁的结构
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二、细胞破碎率

破碎率：
被破碎细胞的数量占原始细胞数量的 百分数。
1）直接记数法
2）间接记数法
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1）直接记数法

平板计数技术
需时长；只有活细胞才能计数；会产生
误差

血球细胞器上用显微镜计数
快速而简单，但细胞小计数困难
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一般过滤：微生物、动植物细胞 过滤
膜过滤：蛋白质等物质的选择性分离
一般过滤：以压力差作为推动力。
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二、离心沉降

沉降法：指固体颗粒在外力作用下与液体 物质做相对运动最终实现固液分离的技术。

沉降法根据作用外力的不同，可分为重力 沉降和离心沉降。
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第一节 细胞分离 部分微生物胞内酶
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胞内重组药物
设计试验，请用生物工程学的原理和方 法生产治疗糖尿病的胰岛素？
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分离胞内产物与胞外产物的差别是什么？
为回收和提纯胞内产品, 必须先将它们从
胞内释放到胞外, 然后进行分离纯化。
可以采用分泌性宿主使胞内产物直接分