二、时间分辨荧光分析法基本原 理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物 标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针 或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部 分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反 应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、 靶细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后, 用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强
2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后 从激发态的最低振动能级返回到基态时所 发射出的光称为荧光(fluorescence)。
• 5.时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA）
• 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技 术，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏 度高达10-19g/ml，较放射免疫分析（RIA） 高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或 抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点， 用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长
四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫
应答反应,而且在肿瘤、炎症发生和发展过 程中起重要作用。因此,准确测定细胞因子 含量,对于了解它们病理生理作用是十分重 要的。 1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾
2.在微生物方面的应用 由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它
1.2 稀有元素双功能螯合剂
稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原 抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能 基团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基 或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离 子连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨 酸、酪氨酸) 连接。
1.3 增强Biblioteka 液免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓 冲液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱, 这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所
五、时间分辨荧光分析法在真菌 毒素检测方
1.真菌霉素概述 面的应用
真菌毒素是由产毒真菌( 主要为曲霉属、 青霉属及镰孢属) 在适宜的环境条件下产生 的具有很强毒性的二级代谢产物，它主要对 食品、农作物及饲料等污染很严重。
当前，最主要的真菌毒素主要有: 黄曲霉 毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、T-2 毒素、 展青霉素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌 烯醇等。
2.基本技术：
2.1 包被技术
TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素, 因此在包被抗体之前,往往要对抗体进行纯 化,以提高抗体的包被量和均一性。国内外 最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的碳 酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH 为4.5 ,效果明显优于碳酸盐缓冲系统。
2.2 标记技术
时间分辨荧光免疫原理图
2.优点
• TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素 标记技术的优点: 具有灵敏度高、特异性强、 稳定性好，且测定范围宽，试剂寿命长， 操作简便和非放射性等特点：
• 镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达到 200 nm 以上，很容易分辨激 发光和发射光，从而激发光干扰就可以排 除。
hCG;血清中的甲状腺激素;国外还用它检测 动物的激素;
TRFIA分析血清、EDTA抗凝血浆和柠檬 酸钠抗凝血浆激素含量差别,发现只有在分 析促甲状腺激素(TSH)、胰岛素 (Ins)、TT3、 雌二醇 (E2)、Testo (睾酮) 和Prog(孕酮) 时 柠檬酸钠抗凝血浆与血清有差别。
现在TRFIA已经取代RIA、EIA等方法,检
2.真菌毒素的测定方法
• 目前，真菌毒素的测定方法有 TLC 法、 HPLC 法等，这些方法都不同程度地存在着 样品前处理过程复杂、毒性大、所需时间长 等缺点。由于其他荧光物质、色素、结构类 似物对检测产生干扰，必须通过液-液萃取 进行净化处理，操作烦琐，有机试剂用量大， 提取效率低，环境污染严重。
抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标 记物标记到抗原或抗体上。标记时不同蛋白 质的反应性依赖于蛋白表面的游离氨基酸数 目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨
2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相 抗体竞争法。
2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不 同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体,经过免疫反应形 成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完全 解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合 剂结合,在协同剂的作用下,形成一个Eu3 +包 裹于其内部的微胶囊(胶态分子团) 。它在激 发光作用下能发射出很强的荧光信号,其强 弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于 测定蛋白质类大分子化合物。
• 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系
三、时间分辨荧光分析技术简介
• TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素 双功能螯合剂、
分析缓冲液、增强溶液。
• 基本技术包括包被技术、标记技术、反应 模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中
的 ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇 (yttrium , Y)和镧系元素。到目前为止,只有 铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、钐 (samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、 镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示
的理论形成后, 研究重点放在试剂开发和利用上；
1982年研制出用于测定风疹病毒抗体 TRFIA的试剂； 1986年开创快速诊断流感的TRFIA方法； 2002年有关于同时检测弓形体IgM和IgA抗 体TRFIA方法. 3.分子生物学的应用
标记的链霉亲合素2生物素探针,则会使核
4.在激素方面的应用 用TRFIA检测人血清胰岛素含量;检测了
时间分辨荧光分析法及其应用
目录
• 一、时间分辨荧光分析法的基本概念 • 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 • 三、时间分辨荧光分析技术简介 • 四、时间分辨荧光分析法的应用 • 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测
方面的应用 • 六、展望
一、基本概念：
1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种 波长的光之外还会发射出波长相同或比吸 收波长更长和的光，这种现象称为光致发 光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。