微生物工程实验指导适用生物技术专业食品与生物工程学院2008.1实验一 发酵实验用玻璃器皿灭菌前的包扎方法一、目的：学习发酵实验用玻璃器皿在灭菌前的包扎工作，并了解灭菌后的使用方法。

二、原理：为保持发酵实验用玻璃器皿灭菌后的无菌状态，需要对它们灭菌前进行包扎，这些工作看起来简单，但如操作不当或不按操作规程去做，则会影响实验结果，甚至会导致实验的失败。

三、材料和设备5ml吸管30只，9cm培养皿 10套，120*12mm试管 120只，250ml三角瓶30个，脱脂棉0.5斤，天然棉0.5斤，8层纱布30块，线绳。

四、方法1、洗涤1 新器皿应用2﹪盐酸浸泡数小时再洗涤。

2 琼脂块不能倒入下水道。

3 含菌培养基一般先煮再洗。

4 洗涤后玻璃器皿上水应均匀湿润而无条纹和水珠。

2、包扎① 平皿的包扎：10个一包。

前9个方向一致，最后一个反放，用纸卷成卷，也可放在特制铁桶中灭菌。

② 吸管的包扎：在吸管尾部塞入少许脱脂棉，脱脂棉长约1cm，距管口约0.5cm，以防止在使用时造成污染。

脱脂棉松紧适当，多余的棉花可用火焰烧掉。

每支吸管用约6cm宽纸条，吸管头部包衬双层纸，以30－45º卷起，吸管尾部用剩余纸条打成一结，防止散开，标上容量。

使用时，从吸管中间凝断包扎纸带，抽出吸管。

③ 试管的包扎：用天然棉做成棉塞，紧贴管臂，松紧适宜，棉塞要实，2/3塞进管口。

也可用硅胶塞。

十只一把，外加牛皮纸，扎好。

脱脂棉易吸水，可能造成染菌。

④三角摇瓶的包扎：用8层纱布（大小适宜），塞入瓶口2/3，瓶外部分揪成一团，再用一层牛皮纸或两层报纸把纱布遮严（以免打湿），包扎，用绳子系成活扣。

使用时，去掉包扎纸，拿去纱布，接种后，将纱布塞进瓶口，纱布四角拉下，用绳子系成活扣。

五、作业体会这样做有哪些好处？实验二 灭菌技术及其应用一、目的：掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和操作。

二、原理：灭菌的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌目的。

电热干燥箱适用于玻璃器皿的灭菌（培养皿、吸管等），高压蒸汽灭菌锅适用于含水培养物和玻璃器皿的灭菌。

三、材料和设备电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅。

四、方法：（一）电热干燥箱操作步骤及注意事项：1．装箱将准备灭菌的玻璃器具洗涤干净、晾干，用纸包裹好，放入电热干燥箱内。

关好箱门。

2．灭菌接通电源，打开排气孔，温度升至80℃－100℃时关闭气孔，继续升温至160℃－170℃，恒温2h。

3．灭菌结束后，断开电源，自然降温至60℃，打开电热干燥箱门，取出物品放置备用。

注意事项：1．器皿在烘箱内不宜装得太满、太紧，以免影响温度的均匀上升。

2．灭菌物品不能直接放在烘箱底板上，防止包纸烘焦。

3．灭菌温度恒定在160℃－170℃为宜，温度过高，纸和棉花会被烤焦。

4．降温时，待温度自然降至60℃以下再打开箱门，取出物品，以免因温度过高而骤然降温，导致玻璃器皿和玻璃箱门炸裂。

（二）、高压蒸汽灭菌锅操作步骤及注意事项：1．加适量水，放入物品。

物品间要有空隙，盖子对称拧紧。

2．通电加热，将锅内空气排放干净，排放空气的方法有两种，a.开放气阀，待冒热蒸汽3－5min即可；b.压力升至0.05Mpa时打开放气阀，使压力降为零。

放完空气后，关闭放气阀，压力在0.105-0.13Mpa之间时，计时约25分钟左右。

（含糖多、有生物活性物质的培养基，灭菌压力应小些，时间长些。

）3. 锅内压力降为零后，方可开盖取物。

注意事项：1.在使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气的排除是否完全极为重要。

当水蒸气中含有空气时，压力表所表示的压力是水蒸气压力和空气压力的总和，不是水蒸气的实际压力，对应的温度不是灭菌器内的实际温度，实际温度偏低，达不到灭菌所需的温度。

因此，必须将灭菌器内的冷空气完全排除，才能达到完全火菌的目的。

2.不能在压力尚未降到零时就打开锅盖或强行放气，否则易造成灭菌有效时间缩短和容器中的液体爆沸。

3.对某些体积较大或蒸汽不易穿透的被灭菌物品，如固体曲料、土壤、草炭等，则应适当延长灭菌时间，应将灭菌时间延长至1～2h。

三、作业：实验中可能会出现什么问题？如何解决？实验三 学习接种技术和超净工作台的使用一、目的：了解接种前的准备工作，掌握各种接种方法和超净工作台的使用方法。

二、原理：微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。

由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。

为此，接种必须在无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。

同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种环、接种针、移液管和玻璃涂棒等。

三、材料和设备大肠杆菌斜面，黑曲霉斜面，肉汤斜面，查氏培养基斜面，超净工作台，接种室（接种室 5平方米、缓冲室 2平方米，高≤2.5m；设推拉门，接种室与外室有小厨窗，用于传递物品及减少人员进出次数）。

四、方法：1、接种前的准备工作：5﹪的石炭酸喷雾，拖地；75﹪乙醇擦拭台面，将所有接种物品先放入超净工作台内，打开超净工作台风机和紫外灯，预热、杀菌30min。

2、接种75﹪乙醇擦手。

接种时，动作应准确迅速，注意无菌操作。

细菌采用划线法接种，霉菌采用菌块或孢子划线接种。

每人接细菌斜面（大肠杆菌）和真菌（黑曲霉）斜面各一只。

（标上日期、时间、姓名）3、培养细菌斜面37℃培养1天，真菌斜面28℃培养2天，观察是否染菌。

五、注意事项：1．所有接种物品应一次性放入超净工作台内。

2．超净工作台内物品不可放的太满，酒精灯与进风口之间不可放置高大器皿，以免应响接种效果。

3．接种过程中，开盖15min的营养琼脂平板，盖盖37℃培养24－28h 后，平板内菌落数不超过4个，则认为接种室无菌程度良好。

六、作业：1．接种前为什么超净工作台要预热30min。

2．接种前后为什么要灼烧接种环（钩）。

3．操作过程中可能会出现什么问题？如何解决？实验四 活性干酵母的酒精发酵一、实验目的酒精发酵是典型的糖的无氧酵解途径。

通过实验让学生理解糖的无氧酵解途径并了解厌氧发酵的工艺过程。

二、实验原理在无氧的培养条件下，酵母菌利用糖发酵为酒精和二氧化碳的作用即为酒精发酵，反应式为：C6H12O6 2C2H5OH ＋ 2CO2通过对表观发酵度的测定，可以判断酒精发酵的进程。

表观发酵度公式为：发酵度 = (D-d) / D × 100％D表示未发酵时的糖度，d表示发酵后摇动去除二氧化碳后的糖度。

三、实验材料及仪器手持糖度计，蔗糖，活性干酵母，250mL三角瓶；100mL烧杯，8层纱布，线绳，玻棒，10％HCl，pH试纸，10mL吸管，试管。

四、实验方法1.活性干酵母活化：称取2g活性干酵母，用10mL的2%蔗糖溶液，38℃保温活化30分钟。

2．培养基制备：将pH为5.5的 10％蔗糖溶液的装在250mL三角瓶中，装液量为200mL。

121℃灭菌10分钟。

3．接种发酵：将活化好的酵母，以5％的接种量，接入到蔗糖溶液的中，35℃静止发酵48小时。

4．每间隔12小时测定1次表观发酵度，观察发酵现象。

五、作业：1．发酵前，为什么要对活性干酵母进行活化？2．酒精发酵时，为什么培养基不需要彻底灭菌，也能保证正常发酵？3．通过对表观发酵度的测定，记录酒精发酵的进程。

实验五 酸奶发酵剂的制备及酸奶的酿制一、实验目的学习并掌握酸奶制作的基本原理和方法。

二、实验原理酸奶是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品，是具有一定保健作用的食品。

其基本原理是通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中酪蛋白(约占全乳的2．9％，占乳蛋白的85％)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。

同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味(与形成乙醛、丁二酮等有关)。

按凝固状态可将酸奶分为凝固型酸奶和搅拌型酸奶，二者基本工艺过程相似，本实验主要学习凝固型酸奶的制作方法。

三、实验器材1．菌种：一般选用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。

也有使用嗜酸乳杆菌(L．acidophilus)和双歧乳杆菌如两歧双歧乳杆菌(Bifidobacterium bifidum)的，目前虽然有人认为它们保健作用更好，但由于不易培养和有特殊异味，尚未全面推广使用。

本实验使用前两种菌以 1：1比例混合接种。

2．培养基：菌种活化及扩大用培养基：10％脱脂乳液，pH自然。

发酵培养基：16％全脂乳液加适当比例(如8％)的白砂糖，pH自然。

3．器材：试管、烧杯、三角瓶、无菌吸管、酸奶瓶、温度计、玻璃棒、酒情灯、电炉。

四、实验方法1．工艺流程：全脂乳粉、砂糖、水 混合均匀 预热(60-70℃) 均质(15-18MPa)灭菌(85-90℃，5-8min) 冷却(43-45℃) 接种 分装封口 菌种 活化 母发酵剂 生产发酵剂保温发酵(42-43℃，2-3h)酸奶瓶 清洗 开水烫洗消毒冷藏(2～5℃)成 品2．菌种活化和培养：（1)将脱脂乳液(要求乳粉或生新鲜牛乳不含抗生素)分装试管和三角瓶．装量：18mm×180mm试管：10mL／管；250mL三角瓶：150mL／瓶。

置于高压灭菌锅内115℃，15min灭菌。

（2)将保藏菌种接入脱脂乳试管中活化2次，至凝固良好时，转接于三角瓶中(做成母发酵剂)，接种量2％左右。

大规模生产时还需进行下一级扩大培养(即做生产发酵剂)，接种量2％～3％。

（3)生产发酵剂培养需采用较大的容器，如不锈钢桶，灭菌则采用80℃、15min，连续两次。

灭菌后牛乳应立即冷却待用。

如1h内不使用，需储放在3～-5℃环境下。

（4)培养：保加利亚乳杆菌一般在42～45℃下培养12h，至牛乳凝固结实即可。

嗜热链球菌一般在37～42℃下培养12～14h，至牛乳凝固结实即可。

3．发酵培养基的消毒：将乳粉、砂糖和水按比例混合均匀(实验室小规模制作可用打浆机打浆，使充分混匀，代替均质)，在不锈钢容器(或烧杯)中加热至85～90℃保持5～8min即可杀死病原菌和其它微生物。

4．接种：将消毒后的牛乳迅速降温至45℃以下，接入发酵剂的量为原料乳量的10％。

采用混合菌株发酵时，总接种量不变，两菌株等量接种。

5．分装、封口、发酵：接种后，分装于消毒过的酸奶瓶或其它容器中，加盖或封口后送培养箱或发酵室保温发酵3～4h。

6．冷却后熟：经检查，酸奶已达到凝固状态(pH达4．2～4．3)时，取出置4℃条件下冷藏24h即得成品。

品尝自己制作的酸奶，判断其感官品质是否达到要求，若达不要求，分析其原因。

实验六 草莓果酒的酿造一、实验目的学习并掌握酸果酒的酿造的基本原理和方法。