实验四环境中微生物的检测和分离纯化
一、实验目的
1.熟悉常用微生物培养基的配置方法。

2.学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。

3.用平板划线法和稀释法分离微生物。

4.认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。

二、实验原理
土壤中有数量巨大、种类丰富的微生物，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的是平板分离法。

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。

三、实验器材
土样10g，牛肉膏蛋白胨培养平板20个，未知菌种平板，当天降雪；
平皿，涂棒，接种环，无菌200ul, 1000ul吸头，记号笔，酒精灯，取液器:1000ul 、200ul 各一支，培养箱；
0.9% 无菌生理盐水，250ml三角瓶中装99ml生理盐水,每瓶加约20粒玻璃珠，250ml 三角瓶中99ml生理盐水,作100倍稀释用。

四、实验步骤
1.配置培养基：取牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000ml配置培养基，调
pH至7.2，灭菌。

于讲课前倒板20块。

2.采集野外样品：选择肥沃土壤,去表层土,挖5~20cm深度的土壤数10g,装入烧杯,带
回实验室;取校河水装入烧杯，带回实验室；取新积雪中间层转入烧瓶，带回实验
室。

3.制备土壤稀释液：称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，
用手振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。

用200ul的无菌吸头从中吸
取0.1ml土壤悬液，注入事先分装有0.9ml无菌水的试管中，吹吸3次，摇匀（10-3）。

类推制得10-4、10-5的土壤悬液。

4.涂板：
1）土壤稀释液（9块）：用无菌吸头，分别吸取10-3、10-4、10-5浓度土壤稀释液100ul，较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃
涂棒涂匀。

每个浓度做3个平板。

2）单菌落划线（4块）：用接种环挑取未知平班上的菌落，做单菌落划线分离，每人2板。

3）手指（1块）：分别用未洗过的手指头, 用自来水打湿的手指头，用自来水洗过的手指头，用肥皂洗过的手指头和用酒精棉球擦过的手指头(不用毛巾擦)在同
一平板的不同分区涂抹（用力一致）。

4）硬币（1块）：取3枚1角硬币，按在平板的3个分区。

5）头发（1块）：放置一根头发，用无菌图布棒压紧在培养基上。

6）牙垢（1块）：用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线。

7）空气（2块）：打开培养皿置实验台上（空气中）10min，按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min。

8）积雪（1块）：用移液器吸取100ul雪水，较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀。

5.培养：用报纸包好倒置35℃培养箱里培养24小时。

6.观察结果：对土壤稀释液平板进行计数，单菌落划线平板分离单菌落，其他平板观
察微生物种类、数量。

所有平板都要照相。

五、实验结果
1.土壤中微生物计数
结果如图1。

计数结果如表1。

图
1.土壤稀释液平板培养24h结果。

a、b、c，稀释10-3倍，1－3号；d、e、f，稀释10-4倍，1－3号；
g、h、i，稀释10-5倍，1－3号。

表1.土壤稀释液微生物计数结果
稀释倍数组号平均值/个微生物浓
度/（个/ml）
1 2 3
10-3258 280 无法计数269 2.69×106 10-4无法计数122 无法计数122
10-5 1 0 0 0.33
2.单菌落划线
划线结果见图2。

图2.单菌落划线平板培养24h结果。

由图可以看出，只有b板有少许单菌落出现。

3.其他样品
我们还自己设计了7块平板，培养结果如图3。

对比a和b，菌落数为11：2，可见平时无菌操作是有很大必要性的，但也说明对于一些要求不高的实验，完全没有必要谨小慎微地严守无菌操作要求，空气中地微生物数量不是很多，与土壤、手指相比完全可以忽略。

c板中头发周围长了少量菌落，看似不多，但是要知道这只是1根头发，我们头上有数万根这样地头发，会有多少细菌藏身？可见保持个人卫生的重要性。

相比头发，d板中牙垢就干净些，可能与口腔中环境与空气有区别有关。

e为平时使用的硬币，有培养结果可见上面微生物非常多，提醒我们平时接触完货币后要洗手。

说到洗手，f板让我们大吃一惊，感觉上是越洗越脏！
肥皂洗过后并不比没洗时干净！这是突然想起了××佳香皂的广告，感觉像是被骗了好多年……g板更是颠覆了我们印象中雪花“洁白无暇”的美好印象，培养的结果比硬币都脏。

想到昨晚打雪仗时浑身的雪水，忍不住想要换洗全身衣服。

六、讨论
1.土壤稀释液平板计数
稀释10－3倍计数结果比较理想，但是2、3两板还是出现了大片菌苔，说明稀释倍数还小。

稀释10－4倍虽然浓度适中，但是美中不足，没有涂匀，无法计数。

其中3号板怀疑是因为倒板后没有放平平板导致平面倾斜，而不是涂布的问题，因为菌液明显集中到了平板的一侧。

稀释10－5倍时，居然没有菌落，按浓度来说不会出现这种情况，可能是稀释时没有吹打均匀，吸取了很多上清液，也可能是涂板时涂布棒过热，杀死了细菌。

2.为什么没有单菌落
第一次单菌落划线操作，结果惨不忍睹。

究其原因，首先，手法不对，在开始时应该划的密一些，让大多数细菌在此阶段进入培养基，越往后划的越疏松。

但是我们的板子看起来前后基本一样，这样不利于菌种的分离。

第二，挑取原菌落过多，用接种针扎一下就够，但是我们因为台子上没有准备接种针，改用接种环，结果接触面积大很多，带出的菌种也就多很多了。

第三，用力过大，划板时经常看到接种环进入了固体培养基内，运动阻力不均匀，划线运动的也就不均匀，造成分离不理想。

3.越洗手越脏？
当然这并不能说明洗手利于微生物生长，可能是因为洗手后残留的水让微生物分布均匀，生长的面积更大；与干手指印比较，有更多的水用于生长、繁殖，长得更好；
更重要的是，自来水不是无菌水，肥皂也没有灭过菌，自身都带有很多细菌，只不过因为长期和人体共存，双方相安无事而已。

因此最好不公用日常洗涤用品，避免发生交叉感染。

日常洗手还是必要的，可以洗去污垢和有害化学物质。

好习惯需保持。

4.雪水这么脏？
我们尽情欣赏雪的洁白时一直忽略了它的形成原因：雪形成最基本的条件是大气中要有“凝结核”存在，而大气中的尘埃、煤粒、矿物质等固体杂质则是最理想的凝结核。

如果空气中水汽、温度等气象要素达到一定条件时，水汽就会在这些凝结核周围凝结成雪花。

所以，雪花的“内心”富集了空气中的污染物，是很黑暗的～难怪会有这么多微生物存在了。

我们也不必因此对雪来个180度大转弯，比起河水、表层地下水来说，雪水算是干净的了，因此古人也有喝雪水、用雪水泡茶、治病的习俗。

七、思考题
1.从你周围环境中微生物的观察,你认为无菌操作应注意什么?
尽量减少暴露时间，暴露时一定要在酒精灯的火焰旁，不能离太远。

无菌部分和污染部分不能接触，避免发生交叉污染。

除了灭过菌的试剂、仪器外，不用任何“自认为”干净的器材。

操作前一定要注意洗手、换实验服。

2.说明饭前洗手,饭后刷牙的重要性。

通过手指、牙垢两张片子，我们看出有大量微生物生活在那里。

需要定期进行清洗，避免外来菌大量繁殖，伤害身体健康。

3.在日常生活中如何讲究饮食卫生?
饭前洗手，饭后餐具厨具充分清洗灭菌。

生、熟食分开存放，分刀具、砧板操作，生食要清洗干净，熟食要加热彻底。

条件允许的话采取分餐制。

不吃变质食品和长时间存放的剩饭菜。

4.试解释夏天时煮好的饭如果放在锅中保持盖着锅盖不动，不容易变质，而一旦盛在
碗里的饭就容易变质，如果是吃剩的剩饭就最容易变质的原因。

夏天空气温度适宜微生物生长。

刚煮好的饭因为经过高温杀菌，且锅盖将之与空气隔离，组织微生物进入；盛在碗里则直接把饭暴露在空气中，会有细菌落在富含营养物质的饭上，快速繁殖使饭变质；吃剩的饭之前与人的唾液、餐具均有长时间接触，已经含有大量、多种微生物，变质速度最快。

5.根据实验结果，试批驳“洁僻行为”。

实验结果3.f、讨论3已经讨论过洗手的问题，可以看出手不是越洗越干净的，总
会感染一些水中和洗涤用品中的细菌，虽然于健康无碍。

因此反复洗手完全没有必要，只是增加些心理安慰而已。

八、参考文献
1．陈金春、陈国强，微生物学实验指导，清华大学出版社，2005年。