大规模细胞培养（large-scale cell
culture）技术：是在人工条件下（设
定ph、温度、溶氧等）高密度大规模的
在生物反应器（bioreactor）中培养细
胞用于生产生物产品的技术。它是细胞
工程的重要组成部分，已成为生物制药
领域最重要的关键技术之一。
一、大规模细胞培养的基本原则
（一）增加培养容积
第二节 细胞核移植
nuclear transfer
核移植与动物 克隆过程
核移植：取核（A/B）---移入新核（C/D）
人类治疗性克隆 human therapeutic cloning
第三节 基因转移技术
一、基因转染原理

将目的基因导入靶细胞,
使之表达

涉及到基因，基因表达元
件， 导入方法， 导入细
半透膜性两端开口的中空纤维，直径约200μm
细胞附着于外表面，内部有培养液通过
利于分泌型表达蛋白的纯化，不易放大培养
Cross-section through hollow fiber culture system showing extracapillary space
Hollow Fiber Cell Culture Systeme
第十一 章 细胞工程 （Cell Engineering）
陈俊霞
现代生物工程（Modern Bioengineering ）
• 基因工程 • 酶工程
• 发酵工程
• 蛋白质工程 微生物细胞工程 •细胞工程‫٭‬ 植物细胞工程
动物细胞工程
细胞工程（cell engineering）
应用细胞生物学发育生物学、遗
• 可使细胞始终处于一个较好的营养状态和生存环境
• 可以在 “旧”培养基中连续收集培养细胞所分泌的某些产
物 • 可以根据特殊的要求，通过改变培养液的组成实现对于细 胞状态的人为调控
三、大规模培养中优化细胞生长的环节
（一）量化评估大规模培养细胞的营养需求 （二）探索大规模培养细胞合适的生存环境 （三）鉴定细胞的健康状况
2. 微胶囊（microcapsule）
半透性膜所围成的囊，直径200μm左右 细胞生长在囊的内壁
细胞密度大(108/ml), 产物浓度高, 分离纯化相对简单
需研究人员自行制备
A scanning electron microscope image of a fractured microcapsule, once filled with healing agent
显微操作系统
显微注射
3. DNA直接注射法
DNA直接注射法主要用于开发核酸疫苗和基因治疗。核酸疫苗也叫基因 疫苗（genetic vaccine）、核酸免疫（nucleic acid immunization）、 DNA免疫（DNA based immunization），是指将含有编码抗源蛋白的基
染色体工程
干细胞工程
胚胎工程
组织工程
工程化细胞的应用 ……
第一节
大规模细胞培养
Large-scale Cell Culture
细胞培养(cell culture)：在无菌条件下，
从机体中取出组织或细胞，模拟机体内正常 生理状态下生存的基本条件，让它在培养器
皿中继续生存、生长和繁殖的方法。可分为
原代细胞培养和传代细胞培养。
胞，表达检测

导入方法很多，大致可分
为：物理法、化学法和生
物学方法
二、基因转染载体

病毒载体
逆转录病毒载体
腺病毒载体 腺相关病毒载体 单纯疱疹病毒载体 EB病毒载体 杆状病毒 慢病毒 嵌合 (杂合 )病毒载体
• 非病毒载体
磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导 多聚阳离子聚合物 电击法 显微注射法 基因枪 超声波辅助转染
GCS technology enables life science researchers to mimic in vivo morphology in an in vitro environment
Glass Ball Spinner Systeme
2. 中空纤维（hollow fiber ）
2.显微注射法
受精卵显微注射技术是制备转基因动物最常用的方法，其基本操作程序 是：将目的基因经过适当的限制性内切酶酶切、纯化并溶解在注射缓冲液 中备用。显微注射时先从供体动物的输卵管内取出受精卵，利用倒臵显微 镜和显微操作系统将所要研究的基因注射入受精卵的雄原核，再将此受精 卵植入受体动物的输卵管中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
与产品纯化的关 系
下游产品纯化容易，产品回收率高，不 存在病原体污染问题，易于产业化
实用性
适用细胞谱系较宽
适用细胞谱系窄。对某于具体的某种细 胞的培养，通常摸索其培养条件。由于 培养基的黏度小，其细胞在培养过程中 易受机械损伤
二、大规模（二）气流驱动培养系统 （三）微载体培养系统 （四）灌注培养系统
传学和分子生物学等学科的理论与方 法，在细胞水平上，按照人们的需要
和设计对细胞的遗传性状进行人为地
修饰，以获得具有产业化价值或其它
利用价值的细胞或细胞相关产品的综
合技术体系,也称细胞技术。
细胞工程所涉及的技术方法
基因操作 细胞的遗传修饰
细胞融合
细胞器移植 细胞的表型分析
细胞重组
细胞和组织培养 克隆技术
③ 甘油处理细胞
3. DEAE-葡聚糖转染法
基本原理： DEAE-葡聚糖是一种高分子量的正电荷多聚体， DEAE-
葡聚糖的作用机制并不甚明了，推测由于高分子量正电荷多聚体可以作
为桥梁连接带负电荷的核酸与带负电荷的细胞外膜。 DEAE-葡聚糖 /DNA复合体通过内吞作用进入细胞后，DNA通过某种未知机制脱离酸度 越来越大的内吞小体，穿过核膜进入核内。 DEAE-葡聚糖最适浓度测定
Fluorescence microscopy image of FITC-peroxides loaded polypeptide microcapsules
（三）抑制细胞凋亡
培养的后期，维持细胞的高活力是关键
细胞凋亡是大规模培养时细胞死亡的主要原因 细胞静止（cell rest）技术可以有效降低营养 成分消耗和代谢毒物产生，对提高培养细胞表 达目的蛋白的产率是一种有效的手段
因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主
细胞表达抗原蛋白，并由其诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以 达到预防和治疗疾病的目的。
（二）生物法介导的基因转染
举例：逆转录病毒载体转染法
1. 逆转录病毒的结构 长末端 重复序列 包装信号 LTR 调节和 启动转录 φ gag pol env LTR
（一）悬浮培养系统（suspension culture system）
• 细胞产量是最高的
• 仅适合于悬浮生长细胞
旋转细胞培养系统（Rotary Cell Culture System , RCCS）
（二）气流驱动培养系统（airlift culture system）
• 被成功培养的细胞有：HeLa、BHK21、人类原始 淋巴细胞以及植物细胞等 • 凡适合于在搅拌悬浮培养体系中生长的细胞都可以
产生病毒 产生 产生病毒 核心蛋白 逆转录酶 外膜蛋白
2. 逆转录病毒载体的构建
将病毒前DNA经适当改造并插入质粒后构建而成
常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的各类逆转录病毒载体
长末端 重复序列 包装信号
LTR 调节和 启动转录 φ gag env 目的基因pol 标记基因 LTR
3.
在本培养体系中生长，如用于制备单克隆抗体的杂
交瘤细胞 • 不需要发动机和搅拌装臵
（三）微载体培养系统（microcarrier culture system）
• 微载体与搅拌悬浮培养相结合的一种培养体系 • 适于贴壁生长细胞的大规模培养 • 微载体培养技术复杂
（四）灌注培养系统（perfusion culture system）
（二）增大细胞的附着面积 （三）抑制细胞凋亡 （四）无血清培养
（一）增加培养容积
首要考虑因素
培养的容积越大，细胞的产量就越高
是提高悬浮生长细胞产量的最重要因素
（二）增大细胞的附着面积
提高细胞产量的另一个重要因素
培养容器中添加细胞附着生长的支持物
常用的支持物主要有：
微载体（microcarrier）
包装细胞(packaging cell)
• 是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）
导入哺乳动物细胞而制备成的一种特殊细胞系。这种细胞因携带有
逆转录病毒基因组而能大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒缺乏包 装信号（ψ序列）而不能包装
• 逆转录病毒载体导入包装细胞后，插入基因组。由逆转录病毒转录
（四）无血清培养
血清培养基与无血清培养基的比较
血清培养基 质量稳定性 存在批次的差异 无血清培养基 有明确的质量标准，避免了批次差异
培养基成份
影响细胞生长的因子多、复杂程度高、 成分明确，培养基可针对不同的细胞株 不明确因素多 进行成分优化，以达到最佳培养效果 血清中蛋白含量 > 45g/l，成分复杂， 且易被病毒或支原体污染，不利于下 游纯化工作，产业化成本高
细菌载体 噬菌体载体

三、基因转染方法和原理
（一）化学法介导的基因转染
1.脂质体介导的转染
DNA通过脂类包被而被转染，这些脂类或者直接与细胞
膜相互作用——膜融合；或者通过非受体介导的内吞作用进
入细胞，推测这可能是在内吞小体内进行膜融合。
转 染 复 合 物 形 成 过 程 示 意 图