遗传性皮肤病产前诊断研究进展吴　艳1,谢艳秋2综述　朱学骏1审校(11北京医科大学附属第一医院,北京100034;21天津长征医院,天津300001) 摘要:本文着重介绍对一些遗传性皮肤病的产前基因诊断方法及近来的发展。

包括:①4种获取胎儿DNA 的方法:羊膜腔穿刺、胎盘绒毛膜活检、孕妇外周血分离胎儿细胞,植入前裂球细胞取材;②基因分析的主要方法:已知突变位点的可采用DNA 直接测序法,等位基因特异性寡核苷酸探针法(A SO ),限制性内切酶片段长度多态性(R FL P s )等方法,对于突变位点未知者则进行家族单体性连锁分析。

关键词:产前基因诊断;遗传性皮肤病中图分类号:R 75815　文献标识码:A 文章编号:100121048(2000)0620309204收稿日期:1999210225作者简介:吴　艳,女,1973年出生,住院医生,博士 许多遗传性皮肤病如大疱性表皮松解症等缺乏有效的治疗手段,部分疾病有致死性,部分即使患者存活下来也会严重影响其生活质量。

因此进行产前诊断,以及早对患儿采取必要的防治措施是十分必要的。

在1992年以前,这类疾病的产前诊断只能在孕18～20周时,B 超引导下取胎儿皮肤活检,作组织病理检查电镜或单克隆抗体免疫荧光检查等以作出诊断[1～4]。

但这种有创伤性的方法会引起流产,胎儿皮肤瘢痕等弊端。

随着分子生物学研究的进展,人们对这类疾病的致病基因有了较清楚的认识,从而使产前基因诊断成为可能。

本文对近年来国际上进行遗传性皮肤病产前诊断的方法与进展作一综述。

1　获取胎儿DNA 的方法111　羊膜腔穿刺(am n i ocen tesis ,AM N )羊膜腔穿刺是在孕15～17周在超声引导下抽取10～15m l 羊水,对其中的胎儿细胞进行培养,经过一周左右在培养细胞约2×106个时收获[9],提取胎儿DNA 。

也可以直接从羊水离心提取胎儿DNA 。

后者所需羊水量比前者大,但母体细胞污染比前者轻。

因为培养时间长了,可让母体的生长缓慢的纤维母细胞和上皮细胞赶上羊水中胎儿细胞的生长[36]。

选择此孕期是由于羊水量大,约250m l ,且有足够的成活细胞用于培养。

随着高分辨超声的应用,早期即孕10～14周羊水穿刺也获得了类似孕中期羊水穿刺的结果[5,6]。

此方法相对简单,技术要求低,在产前诊断成功率高,是目前国内采用的主要方法。

主要并发症有:羊膜腔穿刺可造成自然流产,流产率0.5%～1.5%。

本方法要求高分辨超声,操作熟练,对有解剖不利因素如肥胖、子宫异常的患者不适合用本方法[7]。

112　胎盘绒毛膜活检(cho ri on ic villu s sam p ling ,CV S )即在孕9～11周B 超引导下吸取10～15m g 胎盘绒毛膜组织,进行细胞培养或直接提取胎儿DNA 。

有经腹(TA CV S )、经宫颈(TCCV S )和经阴道(TV CV S )三种途径。

CV S 是目前世界上最常用的,安全、可靠的孕早期产前诊断方法之一。

与AM N 相比它具有能在孕早期进行产前诊断,和可以不需要细胞培养等优越性。

但此方法对设备和技术的要求比AM N 高,国内普及情况不如AM N 。

CV S 主要并发症为自然流产,流产率:TA CV S 3.5%,TV CV S 3.7%～5.5%,TV CV S 无统计资料[10]。

据B u rton 等报道,CV S 可导致胎儿肢体畸形。

他观察391例成活婴儿其中4例发生横断畸形(1%),比正常婴儿1.8 10000的几率要高[8]。

对于双胞胎其胎盘分界不清者最好选用AM N [7]。

目前世界上对遗传性皮肤病的产前诊断多采用CV S 方法[11,12]。

113　孕妇外周血分离胎儿细胞(m aterm alb loodsam p ling )[7]即从孕妇外周血中分离纯化出胎儿有核红细胞,用于产前诊断。

研究表明通过胎盘屏障进入母血的胎儿细胞有三种:有核红细胞、滋养层细胞和淋巴细胞,其中胎儿有核红细胞最适合用于产前诊断。

文献报道可利用抗转铁蛋白()单克隆抗体,经流式细胞计数仪分离得到胎儿单个有核红细胞[13]。

再选用针对CD38和GPA(glucop h rin A)的单抗结合使用提高敏感性。

此方法无创伤,较AM N 和CV S更易被孕妇接受。

但要排除母体细胞污染,提高其特异性;并需进一步开发合适的基因标志,以提高其敏感性。

尽管还没有报道用此方法产前诊断遗传性皮肤病,但随着分离技术的改进和常规化,此方法有可能取代AM N和CV S,成为一个实用的产前诊断方法。

114　植入前裂球细胞取材(p rei m p lan tati on b lastom ere analysis)对于体外人工受精的胚胎,可在8个细胞裂球期,取出其中一个细胞提取DNA进行产前诊断[12]。

同时将其余7个细胞用细胞培养或低温冷冻的方式保存,若基因分析结果表明没有携带异常基因,再将胚胎植入子宫中[14,15]。

此方法避免了孕期进行有创伤性产前诊断所造成的流产等副作用,而且可以在着床前诊断。

但技术要求高,且只适用于体外受精的病例。

目前此方法已应用在诊断囊性纤维化等疾病中[16,17]。

2　基因分析方法对于家系成员及胎儿的DNA进行基因分析,是产前诊断最关键的部分。

面对多种基因分析方法,应根据致病基因突变的特点,选择适合的方法。

可将遗传性皮肤病致病的基因突变分为缺失性突变和非缺失性突变(包括点突变,插入等)两大类。

对于缺失可以用基因定位法(gene m app ing)[7]。

因为遗传性皮肤病的基因突变没有缺失性突变,所以目前没有用此法诊断遗传性皮肤病的报道,故不详述。

对于非缺失性突变又可分为两类,一类是已知突变位点或其好发的热点区域者,可采用直接分析,常用的方法有:DNA直接测序、A SO、R FL P s、变性梯度凝胶电泳(denatu ring gradien t gel electrop ho resis,DD GE)等;另一类是基因突变定位不清或同一疾病存在多个突变,而这些突变又不能分别被检测出来,这些病例应采用家族单体型连锁分析(hap lo typ e linkage analysis)。

211　DNA直接测序适用于已知致病的基因突变的好发区域,且突变多为点突变者。

可根据好发区域设计特异引物,以PCR进行特异性扩增,然后对产物直接测序,检测有无突变。

应用时作正常对照以除外检测到的突变是正常多态性表现的可能。

此方法直接、简便、对于有多个好发区域者可结合异源双链分析(heterrodup lex analysis)筛选,对于出现异常条带的外显子再进行直接测序,使这种方法更经济、省时。

但其要求有直接测序仪,且测序的基因片段长度不能太长。

Jo sep h等[11]于1993年成功地应用此方法对一个表皮松解性角化过度的鱼鳞病家系进行产前诊断。

以往的研究表明该病多为点突变造成核苷酸替换,Jo sep h等根据该病突变好发区域对该家系的K1的H1区、K1和K10的1A和2B区进行直接测序,发现了K10的1A区Y14N的致病突变,而家系中正常成员及50个对照者均无此突变,从而除外其是多态性表现,并对胎儿成功地进行了产前诊断。

Sh i m izu等[18]用类似方法对一个致死型—交界型EB家系进行产前诊断。

分别发现了来源于父母双方的突变位点,并对胎儿DNA可疑片段直接测序,从而进行产前诊断。

B ichak jian等[9]也于1997年成功地用此法产前诊断了一个携带有板层状鱼鳞病致病基因而表型正常的胎儿。

212　等位基因特异性寡核苷酸探针法(allele2 sp ecific o ligonucleo tide,A SO)即针对正常基因和致病基因分别设计了一个20bp左右的寡核苷酸探针,能分别与二者杂交,用这两个探针检测胎儿是否携带有致病基因。

方法有:酶切后电泳杂交法和酶切后直接杂交的斑点法,后者简便较粗略。

A SO为目前产前诊断最常用的方法之一[19,20]。

可用于大范围筛选患者和携带者。

但要设计并标计寡核苷酸探针,还需要特异的仪器读取结果,因此技术要求高。

Sh i m izu等[8]1992年首次运用此方法对日本一例眼2皮肤白化病(O TC)家系进行产前诊断。

针对日本O TC突变好发于3p22p3.21的外显子1、2分别设计了4条寡核苷酸链,与家系成员杂交发现此家系突变在外显子2而胎儿DNA与外显子2标记杂交显示其只与正常型杂交。

因此为健康胎儿。

Joelly2V ailly等[24]对一个致死性交界性大疱性表皮松解症(H2JEB)家系进行产前诊断。

针对该家系LAM B31760delC纯合子为患者,运用相同的方法准确地产前诊断了一个基因型和表型均正常的胎儿。

1994年Sh i m izu等又用此方法成功地对一个H 2JEB 家系进行产前诊断,成为该病亚洲第一例。

213　限制性内切酶片段长度多态性(restricti on fragm an t length po lym o rp h is m ,R FL P )由于人体基因组DNA 中核苷酸变异导致限制性内切酶酶切位点的变化(增加或消失)。

从而用特异的酶切DNA 后,正常人与患者的片段长度会出现多态性,借此可以区分二者。

此方法适用于满足下列条件的家系:①已知突变位点。

②该突变会产生或消失特定的内切酶位点。

这种方法具有一定的局限性,当突变位点没有引起内切酶位点改变时就无法使用,此时可采用A SO 杂交法。

由于要从众多的内切酶中找出合适的内切酶,此方法工作量较大。

M cGrath 等[23]曾用R FL P 对一个隐性遗传的营养不良性大疱性表皮松解症(RD EB )家系进行产前诊断。

研究发现此家系中致病基因为纯合点突变G 2570R ,产生了M n l I 酶切位点,对于家系成员DNA 酶切后结果与临床型一致。

对胎儿DNA 酶切后发现缺乏M n l I 酶切位点。

因此是一个纯合子正常胎儿。

Sh i m izu 等[19]等研究了一个日本H 2JEB 家系,直接测序发现父系致病基因为1929delCA 减少了M ac 的内切酶位点,而母系突变是W 610X 产生了B c 并消失了V an 91I 酶切位点。

用R FL P 方法成功地诊断了一个表型正常的杂合子。

214　家族单体型连锁分析(fam ily hap lo typ elinkage analysis )[24]原理是假定一种DNA 多态性标记和某一致病基因紧密相邻,在同一条染色体上,且比稍远离的基因位点与该致病基因之间有更小的重组几率。

如图1a 已知与正常基因A (黑方框)连锁的是T 2R +,而与突变基因a (白方框)连锁的T +R +,通过检测T (+ -)就可以得知其继承了正常 异常基因。