概述
根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间,可算出单 个分子发射的最大光子数为105~106。目前光学检测 系统收集、检测光子的效率约为1%或0.5%~5%,故单 个分子仍可被检测到数千光子信号。 检出限约为10-13mol/L
分子发光分析
概述
3.两个基本要求：
在被照射的体积中只有一个分 子与光子发生相互作用，可以 通过调整体系的浓度或密度来
单分子酶催化反 23.6.2单分子ATP酶活性研究
肌球蛋白的S1亚基通过白蛋白-生物素卵蛋白涂层结合到玻璃表面，在S1片段 上有一个ATP酶活性，能切割Cy3标记 的ATP。蛋白质也有Cy3标记，使得单 一酶分子位于滑道上，ATP酶标签定位 后，绑定在S1片段上的Cy3被光漂白， 以消除其散射光的影响。当Cy3-ATP / ADP酶固定化之后，会发生荧光强度的
在高光照条件下检测室会发生荧 光闪烁现象，这种单一荧光团的闪烁 可以简单的光物理模型进行解释，荧 光团闪烁的主要来源是系统的交叉三 重态。 如果背景信号来自自发荧光，那 么入射强度的增强不会引起信噪比的 增加。 在开始时，随着如射强度的增加 ，光子计数率呈直线增加，并很快达 到最大值。
四甲基罗丹明标记的脂质分子的光子计数率
F.分子信 标 F.分子马 达
荧光单分子检测的应用领域
分子发光分析
分子发光分析
荧光偏振
单分子荧光分子具有唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩，分 子只吸收偏正方向与其偶极矩方向一致的光子。因此在偏振
激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向
，可以确定单个荧光分子的空间取向。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
影响分子检测能力的因素： 由于样品中杂质产生的背景干扰；
分子发光分析
23.6单分子荧光检测的生化应用
23.6.1单分子酶动力学
用荧光标记的酶分子或底物反应，
在反应过程中会发生酶的构型变化，使 绿色荧光的量子产率增加，引起绿色荧
底物分子
酶分子
光强度的增加；通过检测反应过程中荧
光强度的变化，对酶促反应进行实时监 测，从而获得与酶促反应有关的丰富的
动力学数据。
瞬时增加。
分子发光分析
23.7单分子荧光检测的其他应用
由于单分子检测具有快速、选择性强、纳米级分辨率、检测限 低、可进行实时监测等特点而在生物化学、医学、生命科学物理等 领域得到了广泛的应用。
A. 单分子 荧光寿命估算 H.单分子 传感器 G.偶极辐 射成像 B. 单分子 取向成像
C. 单分子 取向和旋 转运动 D.单分子 共振能量转移 E.时间分辨 单分子研究
单分子荧光检测与荧光相关光谱
分子发光分析
主要内容：
单分子荧 光检测
荧光相关光 谱在单分子 检测中的应 用
荧光相关 光谱
分子发光分析
概述 概 念：
单分子荧光检测是检测灵敏度达到分子水平的一
系列高灵敏检测技术的总称。已经达到了分子检测灵敏
度的极限。它能对单个分子进行检测和成像，而且可以 通过对单分子的光谱性质进行测量，从而对化学反应的 途径进行实时监测，能对生物大分子进行探测并提供分 子结构与功能之间的信息。其检测的空间尺度能达到纳
，可以反映局部微观环境的信息。可以得到在特殊时刻，特定分子 的特殊位置和行为。
采用单分子效应可能观察到未知领域的新效应。如单分子体系的波
动行为或不确定行为。
分子发光分析
概述 2.单分子荧光的产生原理：
荧光的产生原理可以用右图来描 述： S0 、 S1 、 S2 分别表示分子 基态、第一和第二激发单重态。 T1 为激发三重态，分子吸收光 子后，被激发到 S1 、 S2 较高的 能级之后，迅速弛豫到 S1 的最 低震动能级，然后发射一个荧光 光子，同时使分子回到 S0 的较 高激发态，并弛豫迅速到 S0 的 最低震动能级。分子便处于新一 轮的激发和发射循环。 分子发光分析
滤光器 电感耦合摄像机 更直接 棱镜 物镜 更方便
常用的宽视场检测方法。两种方
法都是基于倒置显微镜。 使用第一种方法是要使入射光瞄
准物镜的焦点。
绿色荧光蛋白图像
分子发光分析
23.3SMD光学装置
另一种限制检测体积的方法是共
焦光学和逐点检测，其所用的是 一种光子探测器（SPAD），其原
光纤
理如右图所示。单点检测器的存
米数量级。
分子发光分析
概述 1.单分子检测的理论意义:
通常对大量分子集合体的观察测量只能反映分子的平均效应，这种
平均效应掩盖了许多特殊的信息；而这些特殊的信息在研究具有非
均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构式显得尤为重要。 体系中各个分子的变化过程与时间密切相关，单分子检测可以对体
系中的单个分子进行研究；单分子的特征对局部场的存在非常敏感
相对于单个罗丹明6G分子的水 的拉曼散射强度
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系 统 23.2.1全内反射（TIR）
分子发光分析
23.2全内反射和共聚焦光学系 统
23.2.2共聚焦光学检测系统
通过物镜照明的方法叫落射照明；
滤光镜
激发光 发射光
检测器
入射光能激发照射锥里面所有的荧
光团； 发射光通过物镜被回收，称为荧光
和梳状陷波滤波器。
全息陷波滤波器吸收光谱图
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.2SMD滤波器
在532nm的激发光下，选用不同的滤光 器检测尼罗红得到的光谱图。陷波滤波 器、长波通滤波器、双色向滤波器。
通过特定的发射滤波器是尼罗红 的荧光强度明显减弱。
分子发光分析
23.5单分子光物理性质的研究
在，使样品不直接成像。一个时 间点之观察一个点。
单分子荧光蛋白共焦荧光图像
分子发光分析
23.4SMD检测设备 23.4.1用于单分子检测的检测 器
SPAD（光子探测器）——单分子单点测量优选检测器，有以下优点： SPAD连同单光子计数电子设备，只需一个5伏的电源即可工作； 量子效率更高，能达到60%~90%； 背景计数率低，能见效背景干扰； CCD（电感耦合检测器）——用于单分子成像 由一个像素阵列构成，每个像素点都是一个独立的检测器；
实现。
单分子的新号要大于背景的干 扰信号，要减少拉曼散射、瑞 利散射及其它杂质荧光造成的 干扰。缩小探测体积能有效减
少背景干扰。
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概述 4.单分子荧光的特征：
量子跳跃
发射－暗态交替的量子跳跃过程是单分子荧光的典型特征，
取决于单分子的周围环境和猝灭途径，是实验中单分子荧光 光谱和荧光强度涨落现象的原因。
溶剂杂质荧光产生的背景干扰；
分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的光子数不同；
提高分子检测能力的方法：
单分子信号与探测体积无关,而背景正比于探测体积，采用pL(皮升) 、或fL（飞升）级探测体积；
结合光谱滤波和时间分辨等技术。
分子发光分析
23.1单分子的可检测能力
罗丹明6G是单分子检测常用的 一种荧光染料，右图显示了罗丹 明6G的发射光谱和溶剂乙二醇 的拉曼光谱图。
CCD不是光子计数探测器，而是一种集成探测器，每个像素点的信号
正比于入射光子的数量； 像素点的噪音不会随时间二增加，且有较高的量子效率。
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23.4SMD检测设备 23.4.2SMD滤波器
在单分子检测中，除去激发波长处的 散射光的影响是非常必要的。根据原
理的的不同可以分为全息陷波滤波器
配置；
散射光被双色向滤光镜分离出来； 双色向滤光镜是一种能透过一些波
长的光，二反射其他波长的光的装
置。
共聚焦光学检测原理
分子发光分析
23.3SMD光学装置
几乎所有的单分子荧光检测器都 使用光学装置限制观察体积。在 宽视场检测和逐点检测中用到了 不同的方法。在宽视场检测中最 常用的是全内反射，右图是两种