多糖结构分析
多糖在生物学上的重要意义，尤其是在医药学上的重要意义决定了多糖研究的迅速发展，多糖构效关系的研究已成为多糖研究的热点。
但由于多糖结构的复杂性和多样性，其结构测定远远落后于蛋白质和核酸,本实验选择天然多糖（半乳葡萄甘露聚糖）作为实验材料，对其一级结构做初步的分析。
多糖一级结构的分析包括：纯度鉴定，分子量测定，单糖组成测定和糖链的序列测定。
糖链的序列测定包括：单糖残基在糖链中的次序，单糖残基间连键的位置，链的分支情况等诸多方面。
【实验目的】
1.了解多糖结构分析的内容及方法。
2.了解多糖一级结构分析的基本原理。
3.掌握多糖一级结构分析的基本方法。
一、糖含量测定
【实验原理】
苯酚—硫酸试剂与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm 处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。
【实验材料】
1. 实验器材
721型分光光度计。
2. 实验试剂
(1)98％的浓硫酸。
(2)80％苯酚：80g苯酚加20ml水使之溶解，可置冰箱中避光长期贮存。
(3)6％苯酚：临用前用80％苯酚配制。
(4)标准葡萄糖溶液（0.1 mg/ml）：取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，定容至1L。
(5)多糖样品：半乳葡萄甘露聚糖溶液（0.1 mg/ml）。
【实验操作】
1. 制作标准曲线：
取9支干燥试管，按下表操作
横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，绘制标准曲线。
2. 样品含量测定：
取样品液1.0ml，按上述步骤操作，测光密度。
3．计算:
糖含量(%)=C /（C0× V）×100%
C: 由标准曲线查得的糖微克数
C0：样品溶液的浓度（0.1 mg/ml）
V：测定时用的样品溶液体积（1.0ml）
二、单糖组成分析
【实验原理】
多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖，通过纸层析分离，特定试剂显色后与已知糖的标准混合物作对比，可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。
【实验材料】
1. 实验器材
水解管；滤纸；玻璃毛细管；层析缸；喷雾器。
2. 实验试剂
⑴标准糖溶液: 称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖，用蒸馏水溶解，得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20微克~30微克)。
⑵展层剂：正丁醇：乙酸：水=4：l：5 (上层)。
⑶显色剂：苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液(邻苯二甲酸1.6g溶于水饱和的正丁醇100 ml，加苯胺0.93g（相当于0.9 ml）。
⑷BaCO3；1mol/L硫酸。
【实验操作】
l．完全酸水解：
称取20 mg多糖样品，加入1mol/L H2S04 2ml；封管，l00℃水解8小时，然后加入BaC03中和，定量滤纸过滤，滤液留作分析。
2．纸层析：
将层析滤纸剪成7cm×40cm的纸条，距层析滤纸一端2cm处画一横线作为点样线,在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。
用玻璃毛细管点样，斑点尽可能小，而且每点一滴，待点样点干燥后，在同一位置再点第二滴。
然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析，展层时间约为36小时。
3．显色：
将滤纸取出，自然干燥，喷上苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液，100℃条件下15分钟即可显色。
标准单糖混合物色斑在滤纸上由下而上的顺序是：半乳糖-葡萄糖-甘露糖-阿拉伯糖。
与标准单糖混合物色斑比较，即可判断多糖样品的单糖组成。
三、糖链的序列测定
（一）高碘酸氧化
【实验原理】
高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。
反应定量地进行，每开裂—个C-C键消耗一分子高碘酸。
通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类型、多糖的分枝数目和取代情况等。
【实验材料】
1. 实验器材
紫外分光光度计。
2. 实验试剂
(1)溴甲酚蓝指示剂:0.1克溴甲酚蓝溶于250ml蒸馏水中（含1.43毫升0.1mol/L氢氧化
钠）。
(2)30mmol/L高碘酸钠溶液。
(3)乙二醇。
(4)0.01mol/L氢氧化钠溶液。
【实验操作】
1. 制作标准曲线：
取6支干燥试管，按下表操作
2. 样品测定
称取多糖样品25mg，用少量水溶解，加入30mmol/L高碘酸钠溶液,定容至25ml，置于暗处,室温下进行反应，于0，6，12，24，36，48…小时间隔取样0.1 ml，蒸馏水稀释250倍后，使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。
至光密度值达一稳定值时，加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。
由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量。
取2ml 上述反应溶液，测定甲酸的生成量。
剩余部分进行Smith降解。
3. 甲酸测定：
取2ml上述反应溶液，加一滴溴甲酚蓝作指示剂，用0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸的释放量。
【注意事项】
为避免发生超氧化，反应溶液的pH值应控制在3~5，而且一定要在低温、避光处进行。
（二）Smith降解
【实验原理】
Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物(如硼氢化钾或硼氢化钠)还原成稳定的多羟基化合物，然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。
以葡聚糖为例，其反应式如下图：
以1→2位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；Smith降解后产生甘油。
以1→4位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；Smith降解后产生赤藓醇。
以1→3位键和的糖基不被高碘酸氧化；Smith降解后仍为原来糖。
以1→6位键和的糖基或非还原末端基（1→）经高碘酸氧化，消耗二分子高碘酸，同时释放一分子甲酸；Smith降解后产生甘油。
本实验通过纸层析检测终产物中的甘油、赤藓醇和糖。
【实验材料】
0.1mol／L醋酸。
2mol／L硫酸。
硼氢化钾。
纸层析试剂及器材：除显色剂外，同实验二。
硝酸银显色剂：
A: 16%硝酸银水溶液: 丙酮为1：9（V/V）。
B: 1%NaOH乙醇溶液(W/V)。
C: 6mol／L氢氧化铵。
【实验操作】
1. 还原和水解
高碘酸氧化后经乙二醇处理的溶液对流水透析48小时，蒸馏水透析24小时，于40℃以下减压浓缩至10ml左右，加入70mg硼氢化钾于室温、暗处搅拌18小时~24小时以还原多糖醛。
用0.1 mol／L醋酸中和至pH6~7，对流水透析48小时，蒸馏水透析24小时，减压蒸干，加1 mol／L硫酸2ml，封管，100℃水解8小时，用碳酸钡粉末中和，定量滤纸过滤，滤液减压浓缩后，通过纸层析方法检测。
2. 纸层析
操作详见实验2（单糖组成分析）。
展层后，将滤纸取出，自然干燥，喷上试剂A，自然干燥，将滤纸浸入试剂B中，待斑点显出后，再浸入试剂C中以洗去滤纸上的氧化银，然后用水冲洗1小时左右，风干。
以正丁醇：乙酸：水=4：l：5为展层剂时，甘油的R f为：0.48，赤藓醇的R f为：0.35。