基因图位克隆的策略与途径拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物，具有基因组小(125Mbp ) 、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。
同时，拟南芥属十字花科(Cruciferae),具有高等植物的一样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，专门是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活紧密有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第一将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1 、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.用该方法分离基因是按照目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA 序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。
它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。
近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了(图1)。
目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时刻。
在那个 过程中，我们从选择突变体开始，逐步找到和表型有关的基因。
这和反向 遗传学（reverse genetic9的方法正好相反。
图位克隆能实现，关键在于全 基因组测序打算的完成和各种分子标记的发觉。
这些数据被储存在专门的 数据库中（表 1）（ Lukowitz 等，2000）。
表1拟南芥网络资源网站网址Supplemental material for this paper /methods/ppsuppl.html Nottingham Stock Centre ( U.K.) /Recombinant Inbred map /new_ri_map.html Ohio Stock Center (U.S.A.) /aims/TAIR database*， homepageRecombinant Inbred map ( mirror site )CAPS markersSequence tableSNP collectionCEREON collection of polymorphismsSSLP markers/SSLP info/SSLP.htmlTIGR ， genome annotationsDatabase of Ler sequencesKasuza DNA Research Institute ， genome annotationsMIPS genome annotationshttp://websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions"1995Total ■畑rV3 persod-yBar-s-2002TotH=1 porsion-yvEu-«f Q IN 样an<S vitciblM! rruricoTEOKaii<jhRftj riwj<iMj ：u*ar msarfcor iSr •"皿1曲畑Durid ptiy^ic-aJ m-np (YACta a iXZTlK 如Ptw/wMi map甘耳OffMwviorb marker fmm ¥AC* or ccMTTikdBFbrwrf ?%nJilLc mnpping20 kiap 帕石0|扁0!叭ClTic^^ M *I vunrh r 巾和叭 C«f>Kn dawhiAM.htu ONA voqu 口nee 1 tor -C4Odl<Mil« BV&MtHOGde andUrmn eftr nene? Est^i-aridingMerrily oarwSiCjate ejerwii Fwrn C«K> vwwio*(□住釣口口 «*011 tpri-nwim frewTi Cd-O, rhen aoquencaKey in FHftp«b«ft4Kli G I GHIIFTQ process Fk&t-p4a* nwpijlT'bgi 存Q烈M r*»H<i|irtwri|Gen<?r«it9 ptiyvi^Al mApCo reefer cnrdinlAtnmn 世屛 Final iriftmiifiiioaitloin ofmu 怕"dn*注：The Arabidopsis Information Resource (TAIR )在拟南芥中的图位克隆，在专门大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。
实现基因图位克隆的关键是选择与目标基因连锁的分子标记。
实质上，分子标记是一个特异的DN A片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。
迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的选择（Wang等，2000）。
其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNP s）。
SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测专门直截了当，然而我们需要设计引物来检测假定的SSLP 标记；对SNPs标记的检测也比较直截了当，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差不，这些差不的核苷酸通常位于非编码区域（Peters 等，2003）。
最常见的用于检测SNPs标记的方法要紧是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。
另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS （dCAPS）（Nam等，1989; Michaels 和Amasino，19 98）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。
图位克隆法随着有关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表2）。
表2用图位克隆方法得到的拟南芥及一些农作物的基因本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍，以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所关心。
2图位克隆的一样过程因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直截了当。
图2例举了一种高效的拟南芥图位克隆方法。
从基于C ol-0和Ler遗传背景的突变体动身，我们有可能在大约一年时刻内找出与那个突变有关的基因，这其中要紧耗时刻的是五个植物（拟南芥）的生长周期（我们假定每个周期为两个月）。
作为作图过程的第一步，突变体植株将和另外一个生态型（Col-0或者Ler）的植株杂交。
在大多数情形下，用于杂交的突变体植株是作为父本依旧母本是没有关系的。
然后播种F1代种子。
在F1代植物的生长过程中，我们就有可能来对其表现型和基因型进行分析。
F1代植物的表型的显现或者消逝将显示着我们所研究的突变是显性的依旧隐性的。
最好通过对一些标记的分析来确认F1代植物是杂合体，而且在杂交过程中我们没有犯错误。
因此也有必要确认原先的生态型背景。
图2图位克隆过程示意图（Jander 等，2002）F1代植物自交得到F2代种子，大约播种600个个体以进行突变基因的 粗定位（first-pass mapping ,图2）。
在其生长过程中，我们可确定其表型， 大约有150个个体被认为是纯合体（在隐性突变的情形下是纯合突变体， 在显性突变的情形下是纯合野生型）。
然后从这150个个体的叶子或者其它 组织中制备DNA 用于基因型分析。
起先用分布于拟南芥五条染色体上的25个标记（相邻的两个标记之间大约相距 20 cM ）进行分析，确定突变基因 是和哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包 含突变基因的大约20 cM 的遗传间隔。
一旦如此的一个遗传间隔被定义之 后，接下来的工作确实是引入新的标记把那个间隔缩小到大约4 cM 。
一样来讲，利用150个F2代个体是在专门大程度上能找到如此一个遗传间隔的， 距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分 析。
下一步我们将播种一个更大的F2代群体用于突变基因的精细定位（fi ne-resolution mapping ，图2）。
最终目标是将包含突变基因的遗传间隔缩小 到40 Kb 甚至更小（这在拟南芥中大约是 0.16 cM ）。
明显用于作图的F2 代植物rrnjlanl CcHO*outers mu la 砒3grow rF. pla-ris, I 45grow 690 L F piardt e78grepft- 54009F ; [Marts10^progofiy fesling ：1112min m dmwild type LefH l\J F\ goneratian -------------------------d^rnirbantfiTBCiWaiW ：?consider Candida 甩 genesHrarfMM ffiao&n>g -— < 4 cM moMiM eo^BKic4, candidatetfeniiiwh £ir 訐业 丹酚锁阳 600 F ?』a 砒 CO floc 1 SO horrt!础Z 拆. Ihen flenolypeG«i KJ ypa 34MXMOOO F a p^rrts 1B frnd 204300 rocorrtbinaftte ttwi p^ienoiype in F 5ptwicrtypfl!wqutioco DNA押钢沖《cmce^Dys F aphcntMype F.IwfrMMlB maaonu _哥 M kb 伽 oiution considcFcandioale gennal ¥marHarspTi»Oty|X> FrecernbiFianflsmurktr trrurtor 2越多，就越能精确地定位突变基因。