①粘性末端连接，每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分 子上的特定的识别顺序，许多酶作用的结果产生具有粘性末 端的两个DNA片段。例如来自大肠杆菌(Escherichia coli) 的限制酶EcoRI作用于识别顺序
↓…GAATTC… …CTTAAG…↑
（↑指示切点），产生具有粘性末端…G …CTTAA和AATTC… G…的片段。把所要克隆的DNA和…载体DNA用同一种限制 酶处理后再经DNA连接酶处理，就可以把它们连接起来。 ②平整末端连接，某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘 性末端的平整末端。例如来自副流感嗜血杆菌 （Hemophilus parainfluenzae）的限制酶Hpal作用于识别 顺序
6.2.3 在噬菌体载体上克隆
合成cDNA的局限性 1、并非所有mRNA都有polyA结构 2、细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 3、 mRNA在细胞中含量少，队酸和碱敏感， 分离困难 4 、仅仅限于克隆蛋白质编码基因
6.3 从内切酶部分酶切后， 将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因 组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整样每个细胞就包含了一个基 因组DNA片段与载体重组DNA分子，经过繁殖扩增，许多 细胞一起包含了该生物全部NA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上， 然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片 段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某 种生物的全部基因都包含在内的情况下，克隆大片段DNA
许多真核基因片段超过47kb，所以柯斯质粒 被采用。但是质粒噬菌体柯斯质粒都无法分 离整个基因，所以高容量载体BAC,YAC就能 解决这个问题。
当cDNA和质粒DNA混合的时候，有几种可 能的情况。最好的情况就是一个插入的 cDNA连接一个质粒DNA形成一个重组DNA。 如果浓度不匹配，那么可形成单分子串联体 而不是双分子重组DNA.如何区分插入有外源 DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体 分子是较为困难的。通过调整连接反应中外 源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载 体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进 一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸 化等来最大限度的降低载体的自身环化。
完全酶切和部分酶切的区别： 完全酶切，是指使用的内切酶在目标片段上的切点全部切开， 切出来的片段大小不会因为酶量增加，或酶切时间加长而导 致片段大小发生改变（确保不发生星号活性的量和时间）。 克隆构建载体时，就是使用的完全酶切。所有的切点都切了。 部分酶切是指，只对片段上一部分酶切位点产生切割。这种 一般是在建库，或者需要酶切基因组后，获得一定大小范围 内的片段而使用的酶切方法。这种酶切不要求获得某一大小 的片段，而是要获得例如200-500bp的片段，在电泳上没有 条带，而是smear。所以部分酶切需要严格控制酶的用量和 时间，要尝试稀释后的酶液，切一定时间段内，哪一个条件 可以获得目标范围的片段。 部分酶切的条件需要更多的摸索，而且重复性要求也会更高。
Байду номын сангаас
基因克隆即重组DNA技术，指在体外对DNA 分子按照既定的目的和方案，采用酶学方法 将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连 接,组装成一个新的DNA分子。 在此基础上，将这个DNA分子导入到一定的 宿主细胞，使它能够在宿主细胞中扩增，形 成大量的子代分子，此过程即称为基因克隆。
基因克隆包括四个基本技术环节：
↓…GTTAAC… …CAATTG…
而产生末端为…GTT …GAA的DNA片段。用机械剪切方法 取得的DNA片段的末端也是平整的。在某些连接酶（例如 感染噬菌体T4后的大肠杆菌所产生的DNA连接酶）的作用 下同样可以把两个这样的DNA片段连接起来。
③同聚末端连接，在脱氧核苷酸转移酶（也称末端 转移酶）的作用下可以在DNA的3′羧基端合成低聚 多核苷酸。如果把所需要的DNA片段接上低聚腺嘌 呤核苷酸，而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸， 那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过 DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。 ④人工接头分子连接，在两个平整末端DNA片段的 一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里 面包含有某一限制酶的识别位点。经这一限制酶处 理便可以得到具有粘性末端的两个DNA片段，进一 步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起 来。
1、目的基因和载体的获得； 2、目的基因与载体连接,形成重组分子； 3、重组DNA分子导入宿主细胞； 4、含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩 增。
6.1 哪一个方法是最好的
一个是构建感兴趣的生物个体的基因， 即将生物体的基因全部分段克隆，然后建个是用PCR体外扩增技术或者人工化学 合成法直接合成目的基因。
目的基因来mRNA还是基因组DNA是每一个 试验面临的第一个选择。 mRNA有两个优点：1在特定组织细胞里时空 特异性的表达某种基因；2没有非编码基因。 选择了目的基因的物质来源，接下来确定载 体和宿主系统。在目的基因和实验总体目标 确定的情况下，这一系统的选择是相对容易 的。
“If it ain‟t broke, don‟t fix it” By keeping the overall aim of the experiments in mind, the researcher can minimize the effects of such compromises and choose the most efficient cloning route.
6.2 克隆mRNA
指一种特定的mRNA在某个细胞中的平均分 子数。 丰度越高克隆越容易
6.2.1 cDNA的合成
合成cDNA过程中的几个问题： 1、很难得到全长的cDNA片段 2、在核酸酶去除发卡结构时，会去除一些重 要的5‟端序列
6.2.2 在质粒载体上进行克隆
从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶 切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使 两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌, 即可完成。 连接Cdna与质粒有三种方法1平性末端连接2 分子连接3同聚物加尾。
6.3准备。准备DNA片段需要考虑两方面： 1、DNA片段的大小； DNA片段的大小取决于载体的运输能力。超过 100kb是比较理想的。置换型形噬菌体EMBL-4的 运载能力在23kb左右，YAC,BAC在300kb 2、剪切DNA片段的方法。 剪切DNA片段的方法由机械剪切，缺点是不能产生度梯度离心或是 凝胶电泳进行“分馏”。 插入DNA可以通过磷酸化来避免自身环化和 串联体的形成。
6.4 克隆策略展望
6.4.1 cDNA的合成和克隆
保罗伯格和冈山发明的方法，质粒本身成为 引物，mRNA-s1DNA杂交双联与质粒即连接 分子连接后再进行置换反应，将杂交链变为 Cdna双链 。
“策略”就是为了实现某一个目标，首先预先 根据可能出现的问题制定的若干对应的方案， 并且，在实现目标的过程中，根据形势的发 展和变化来制定出新的方案，或者根据形势 的发展和变化来选择相应的方案，最终实现 目标。 克隆即来自同一始祖的相同副本或拷贝的集 合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化,即无性繁殖。
6.4.2 克隆DNA的表达
克隆DNA的表达。有些试验不需要表达DNA，有些 试验需要将序列作为探针或是生产蛋白质等商业用 途，就需要克隆基因的表达。表达时，选用于表达 载体相匹配的菌株。外源基因在原核细胞表达的必 要条件： 1、删除内含子及5„非编码区； 2、外源基因置于强启动子和SD顺序控制下； 3、维持正确开放阅读框架； 4、Mrna稳定且可有效转译，形成蛋白质不被降解； 5、蛋白不需要翻译后加工过程。