三、仪器及试剂
1ห้องสมุดไป่ตู้ 仪器及器材
恒温水浴锅、台式离心机、移液器、电泳槽、电泳仪； 离心管（灭菌）、吸头（灭菌）
2.试剂
细菌基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技 有限公司）、蛋白酶K、无水乙醇、琼脂糖、核酸电泳 缓冲液、DNA分子量标准、核酸凝胶上样缓冲液
四、实验步骤
(一)试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA
7．向吸附柱中加入500 µl Buffer GW2（使用前检查 是否已加入无水乙醇），10,000•rpm离心1分钟，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7.
8. 12,000 rpm（~13,400×g）离心2分钟，倒掉收集管 中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除， 乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。
9．将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间 部位悬空加入50-200 µl Buffer GE，室温放置2-5 分钟， 10,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意事项：
大学生物实验—— 核酸的提取与检测
李长红
/611925 曹光彪科技楼421室
一、实验目的与要求
1、学习并掌握细菌基因组DNA的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测基因组DNA结果的初步分析。
二、实验原理
细菌（bacteria）为原核微生物的一类，是一类形状 细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生 物。
试剂盒组成
抽提步骤
1. 取细菌培养物1 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109 个细胞）置于离心管中，10,000 rpm（~11,500×g）离心 1分钟，尽量吸净上清。
2. 向沉淀中加入180 µl Buffer GTL，振荡使菌体重悬。
3. 加入20 µl Proteinase K，涡旋混匀，56℃孵育，直至 菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离 心管使样本分散。
二、实验原理
细菌基因组DNA提取原理:
采用细菌裂解液使细菌裂解，并 裂解液中的DNA高效特异性的结 合到硅基质离心吸附柱上，而其 它污染物可流过膜，PCR和其他 酶促反应的抑制剂可通过两步洗 涤步骤被有效去除，最后使用低 盐缓冲液或水洗脱，即可获得高 纯度DNA。
纯化得到的DNA可以直接用于酶 切、PCR、Real-Time•PCR、文 库 构 建 、 Southern•Blot 、 分 子 标记等下游实验。
注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 µl 浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液震荡混匀，室温放置510分钟。
4．加入200 µl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀。加200 µl 无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。短暂离心，使管壁 上的溶液收集到管底。
注意：1) 如果多个样品一起操作，Buffer GL和无水乙 醇可以等比例混匀后一起加入，震荡混匀。
根据革兰氏染色法，可将细菌两大类：革兰氏阳性菌 和阴性菌。两者主要是细胞壁的结构不同。
常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆 菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及 脑膜炎双球菌等。
二、实验原理
大肠杆菌（Escherichia coli）是人和动物肠道中最著名 的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。 是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆 菌。
1. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较 小且提取量下降。
2. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1 和Buffer GW2中加入无水乙醇。
3. 使用前请检查Buffer GTL 和 Buffer GL是否出现结晶 或者沉淀，如有结晶或者沉淀出现，请将Buffer GL和 Buffer GTL 于56℃水浴重新溶解。
2) 加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀， 不会影响后续实验。
5．将步骤4所得溶液(包括形成的沉淀)所得溶液全部加 入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液， 可分多次转入。10,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸 附柱放回收集管中。
6．向吸附柱中加入500 µl Buffer GW1（使用前检查是 否已加入无水乙醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收 集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。 洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液 应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到 此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。
注意事项：
4. 离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
5. 用另外的50-200 μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以 增加产量。
二、实验原理
溴化乙锭染色法原理：
溴化乙锭(EB)是一种荧光染料， 常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸 染色。
在紫外光的照射下，未与核酸结 合的EB可被激发出橙红色荧光， 在与DNA或双股RNA结合时， 荧光强度会增强20倍，这种扁平 分子可以嵌入核酸双链的配对的 碱基之间，在紫外线激发下，发 出红色荧光。
二、实验原理
细菌染色体（chromosome of bacteria）：由一条 双股环状DNA分子组成，附着在横隔中介体或细菌膜 上。细菌染色体无组蛋白包绕。
细菌染色体上的基因与真核细菌不同，无内含子，转 录后形成的mRNA不必再剪切、拼接，可直接翻译成 多肽。
大肠杆菌的DNA双链长达1.1~1.4 mm，是菌体长度 的1000倍。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳原理：
DNA分子在pH8.0的电泳环境 中，带负电荷，在一定强度电 场力的作用下，从负极向正极 迁移。
电泳样品载体琼脂糖是一种线 性多糖聚合物，煮沸冷却后形 成网格样结构，电泳中起分子 筛作用。通常情况下，分子量 大 的 DNA 电泳过程中由于受 到的阻力较大，泳动速率较慢， 反 之 ， 分子量较小的 DNA片 段跑在前面。