一、CRISPR-Cas9 细胞基因敲除敲入实验基本操作流程1)设计sgRNA ：1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS 区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子A TG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input 框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。
一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer AdjacentMotif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时设计检测目的基因的引物一起合成）。
1、/2、/mpg/crispr_design/3、/~slin/cas9.html4、/E-CRISP/5、/6、/crispr/,Drosophila7、/index.jsp8、/casot/index.php9、/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx10、/根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458等质粒sgRNA靶点oligo如下（Bbs1酶切）5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5‘（1）对于sgRNA的长度，一般应为20 nt左右；（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%~60%；（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低（4）如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5' 碱基为G或GG，以提高其转录效率；（5）对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的A TG下游，最好位于第一或第二外显子；（6）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；（7）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距；（8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。
重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数，以及脱靶位点是否位于基因编码区等，另外还可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点。
特异性的sgRNA最好存在较少的脱靶位点，不存在种子序列完全匹配的脱靶位点，不存在含有1和2个碱基错配的脱靶位点。
实验前，首先应选择合适的软件进行sgRNA设计和全基因组脱靶效应评估，筛选2~3个活性可能高且脱靶效率最低的sgRNA。
再通过实验验证，依据实验结果选择最优的sgRNA。
2）构建sgRNA表达载体：将两条引物按照如下体系，退火后连接进sgRNA表达载体中，转化DH5a、Stbl3细菌，挑取单克隆测序鉴定。
Annealing and cloning procedure:1. Anneal each pair of oligos:1 µl oligo 1 (100 μM)1 µl oligo2 (100 μM)8 µl H2O10 µl totalAnneal in a thermocycler at 95℃ 5 min and then leave on the bench at RT to cool down for 1hr. Dilute the annealed oligo 1:250 (250 - fold).2. Set up digestion reaction: （pX330/pX335载体和内切酶Bbs I为演示案例）X µl pX330/pX335 or other backbone vector (at least 2 µg)2 µl 10X NEBuffer 2.11 µl Bbs I (NEB) Use more if cutting more DNAH2O to final V olume of 20 µlIncubate the digestion reaction at 37o C for at least 4hr. Run ~200ng on agarose gel to ensure COMPLETE digestion. When digest is complete, heat inactivate (65°C for 20 min) or column purify linearized plasmid.3. Set up ligation reaction:X µl pX330/pX335 BbsI digested vector (100ng)2 µl annealed oligo duplex from step 1 (1:250 dilution)2 µl 10x DNA ligase buffer (make sure fresh, else A TP or DTT may be shot)1 µl T4 ligaseY µl H2O to 20 µl final volume- Incubate the ligation reaction according to manufacturer recommendations.4. Transformation with 1 - 2 ul of the final product into competent cells.5. Pick colony and sequence verify with U6 sequencing primer (U6seqF: ACTA TCA TA TGCTTACCGTAAC)3）质粒制备：用去内毒素试剂盒抽提质粒，测定浓度，琼脂糖电泳检测质粒质量。
sgRNA表达质粒Cas9表达质粒（或二合一质粒）4）培养细胞和转染a）准备培养皿，培养细胞，细胞汇合度70%左右时进行转染。
b）按照Lipofectamine® 2000（或Dfector TM原代细胞转染试剂）转染说明书转染细胞，如果是分开表达的质粒（质粒质量比1:1）c）转染48h或72h后提取细胞基因组DNA，提前设计好检测on-target或预测的off-target引物，PCR扩增目的片段。
（引物在切口两端不对称设计，100:200或者200:300bp）5）T7E1酶切法检测突变体T7 核酸内切酶I 是一种具有底物结构选择性的酶。
该酶以不同的活性作用于不同的DNA底物。
切割特定底物时，必须控制酶量和反应时间。
反应温度超过42℃时，会增加非特异性核酸酶活性。
避免反应温度超过55℃，会导致酶活性降低。
a) PCR扩增出带有突变位点(CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，长度约500bp，突变位点最好不位于PCR片段中央，这样将切割出两条大小不同的带。
b)突变体DNA与野生型DNA的PCR产物按如下体系进行混合，进行加热变性、退火复性处理。
（如果测混合克隆，直接将PCR产物变性，退火复性处理）表1. T7E1酶切体系和反应条件c)上述反应体系分别加入0.5ul T7E1酶，37℃反应30 min后，跑2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。
图2-1. T7E1酶切法检测图图2-2. T7E1酶切法检测图6）测序评估：将PCR产物连接进T载体中，转化进DH5a细菌，随机挑取15-20个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。
图3. 单克隆测序7）PAGE胶检测突变体：制备非变性PAGE胶，检测PCR产物，检测on-target 或预测的off-target sites位点(可选方法)。
图4. PAGE胶检测突变体模式图（REF. SCIENTIFIC REPORTS,2014）8）稀释法筛单克隆先从A1孔（细胞原液约1000个细胞/孔，数量根据细胞状态调整）至H1孔方向对半稀释，然后第一列再横向对半稀释，显微镜观察含单细胞的孔。
9）设计ssODN寡核苷酸（KI）Designing an ssODN template for HR-mediated repair5’ — (~60 - nt 5’ homology) NNN NGG (~60 - nt 3' homology) —3’如果用donor质粒，同源臂理论上越长越好，比如KI 1K左右的基因，同源臂设计在1K bp左右。
二、利用CRISPR系统建立基因敲除动物品系实验过程：2.1 确定待敲除基因的靶位点2.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）2.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒2.4 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA2.5 将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性2.6 将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder2.7 将Founder自交得到F12.8 F1自交得到F22.1 确定待敲除基因的靶位点同前2.2 设计识别靶位点的一对DNA Oligo（引物）同前2.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒同前，选择带有T7启动子的质粒2.4 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA使用特定引物，以上述质粒为模板，以高保值酶分别对Cas9和sgRNA进行PCR扩增，循环数设为30个，20 ul反应体系。