新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞 2、分类
根据细胞分化潜能大小： 全能干细胞（totipotent stem cell）
三胚层多能干细胞（pluripotent stem cell ） 单胚层多能干细胞（multipotent stem cell ） 单能干细胞（monopotent stem cell ）
3.机械剥离ICM培养法： 采用机械法除去胚胎滋养层细胞来分离培养ICM。
4.克隆法： 将（转基因）成纤维细胞注入去核哺乳动物卵母 细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂 至桑椹胚或囊胚。分离ES细胞与全胚培养法相同
（二）、饲养层细胞培养法
MEF饲养层细胞培养法
1.MEF的分离与培养 2.MEF饲养层的制备
干细胞研究是继人类基因组大规模测序之后最具活力、最 有影响和最有应用前景的生命科学领域，1999年干细胞研究被 美国《Science》杂志评为1999年度世界十大科技成果之冠， 2000年再度入选，2002年干细胞研究又被《Science 》杂志列 入值得关注的六大科技领域。
组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决临 床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成为干 细胞应用的主要方向。
根据细胞来源不同：
干细胞
胚胎性干细胞：指源于囊胚内细胞团（ISM）
的胚胎干细胞（ES）。它均属于三胚层多潜能性干 细胞。如：ES细胞、EG细胞、EC细胞等。
成体干细胞：是指那些具有组织特异性的细胞，
它们主要用于维持细胞功能的稳定，具有修复和再生 能力，能够产生新的干细胞，或者能按一定的程序分 化，形成新的功能细胞，使组织和器官保持生长和衰
退的动态平衡。如：神经干细胞，表皮干细胞。
ES细胞：存在于早期胚胎内细胞团的全能干 细胞。
EG细胞：来自于早期胚胎嵴原始生殖细胞的 多能干细胞。
EC细胞：来自于自发或诱发的生殖细胞瘤或 畸胎瘤中的多能干细胞。
二、ES/EG细胞培养建系技术
ES细胞建系：
将早期胚胎（桑椹胚或囊胚）与抑 制分化物共培养，使之增殖并保持未 分化状态，随着传代数的增多，细胞 数量越来越多，直到建立ES细胞系。
1.MEF的分离与培养
妊娠12~14天母鼠 断颈处死 胎儿 去除头、四肢、内脏、尾 躯
无菌
眼科剪
干部剪碎 0.25﹪胰酶+0.04﹪EDTA 消化 37℃、10~15min 离散细胞
离1心000r/min、5min
制细胞悬液
细胞培养液
计数
培养 0.25﹪胰酶+0.04﹪EDTA 制成单细胞悬液
37℃、5﹪CO2、 饱和湿度
• 解冻时，从液氮中将冷冻管取出───37℃水浴中直到溶解 ───70%的酒精消毒冷冻管外壁──加入ES细胞培养液离 心2次除去冷冻液──弃去上清液，以培养液重新悬浮细胞 ───再放入CO2培养箱培养。
目录
一、干细胞简介 二、ES/EG细胞培养建系技术
（一）、ES细胞的分离 （二）、饲养层细胞饲养法 （三）、无饲养层培养 （四）、ES细胞的原代培养和继代培养 （五）、ES/EG细胞系的特性和鉴定
三、干细胞应用（治疗失明）
一、干细胞简介
1、定义 干细胞（stem cell）：是指具有无限或较长期的自我更
（一）、ES细胞的分离方法：
1.全胚培养法 ： 将桑椹胚或囊胚直接培养在饲养层上，
自然脱去透明带，贴壁，与滋养层细胞一 起增殖。当ICM增殖垂直向上生长一定时间 后，挑出ICM，并离散成小细胞团块，继代 培养，克隆增殖。
2.免疫外科ICM培养法： 先用链酶蛋白酶将胚胎的透明带除去，
裸胚在抗体中处理一段时间，再在补体中 作用一段时间，使滋养层细胞发生溶解， 然后直接对ICM进行培养和扩增。
传代培养
2.MEF饲养层的制备
1.取生长旺盛的培养皿+死裂霉素C10μg/mL 处理2~3h 2.吸去处理液，清洗，制成单细胞悬液 （0.25﹪胰酶+0.04﹪EDTA） 3.细胞计数并调整浓度为3.0×10 5个/ mL
4.在6孔培养板中每孔加入0.6mL细胞悬液 37℃、5﹪CO2的培养箱内培养
（四）.ES细胞的原代培养和继代培养
制备好MEF饲养层并添加相应的ES细胞培养液，隔日将囊胚置入培 养（37℃、5%CO2和饱和湿度）。离散的ICM或ES细胞重新接种饲 养层后，可出现各种细胞集落，挑选生长良好，没有分化迹象的 ES/EG集落进行消化扩增。用胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续 培养，一般间隔4～5天用胰蛋白酶消化成小细胞团块或单细胞，克隆 和纯化ES细胞。ES/EG的亚克隆对外界条件的要求十分苛刻，如PH， 酶，温度，培养液成分，细胞密度以及冷冻复苏等体外不稳定环境因 素均影响着ES细胞的分离和克隆。
EG细胞建系：
EG细胞在体外培养增殖能力较ES细 胞弱，所需条件特别是饲养层较ES细 胞严格，所以EG细胞培养建系较ES细 胞困难。
• （一）、ES细胞的分离 • （二）、饲养层细胞饲养法 • （三）、无饲养层培养 • （四）、ES细胞的原代培养和继代培养 • （五）、ES/EG细胞系的特性和鉴定
（三）、无饲养层培养
原理 : 在细胞培养液中添加ES细胞抑制因子使ES
细胞在体外培养环境下保持未分化状态
培养方法
扩张囊胚或孵化胚
分离ICM细胞
实体显微镜下
挑取形态典型的ICM集落 转入ES细胞培养液中进行剥离 转入培养基进行培养
用0.25％胰酶和0.04％ EDTA消化液消化3~5min
用孔径适当的吸胚管吹 打成单细胞或小细胞团 块
2、ES细胞的冷冻与解冻
在ES细胞传代过程中，因其耐受性差需不断对细胞行冷 藏。方法为取对数生长期的ES单细胞悬浮液放入冷冻 液中。冷冻液为75%DMEM+15%新生牛血清（NCS）
+10%二甲基亚砜（DMSO）冷冻开始温度下降速度保持 在13℃/min为宜，当温度下降到-20℃左右时下降速度 可调为5℃/min,到-100℃左右时，可迅速投入液氮。
பைடு நூலகம்
1、ES细胞的继代培养
初次传代后2～3天将出现小的ES细胞集落。待ES细胞集 落充分增值而不出现分化时重新离散，转入新鲜饲养层上。 经数次分离纯化后，ES细胞逐渐扩增，后面每隔4～6天 传代一次。对ES/EG细胞进行消化传代总的原则是尽量缩 短酶消化作用时间，将细胞的损伤降到最低程度且能将集 落消化成小细胞团块（图15-3）。