2 分子荧光光谱仪
入射狭缝 光源 出射狭缝 激发 单色器 样品池
入射狭缝
发射 单色器
放大器
信号输 出装置
出射狭缝 检测器
光源－氙灯和高压汞灯、激光器 单色器－激发单色器和发射单色器
样品池－四面透光的方形石英池
检测器－光电倍增管、电荷偶合元件检测器可
一次获得荧光二维光谱
3 分子荧光光谱的应用
的荧光强度－发射波长的关系曲线，反映了在某一
固定激发波长下，不同波长处分子的相对发射强度。 荧光光谱用于进行荧光测定时选择恰当的测定波长 或滤光片。
同步荧光光谱－同时扫描激发和发射单色器波长的 条件下，测绘光谱图，所得荧光强度-激发波长（或 发射波长）曲线为同步荧光光谱。
① 固定波长同步扫描荧光法：= em -ex不变
但是也有相反的情况，例如苯胺萘磺酸一类的化合物在 戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五种不同的醇溶液中，
随着溶剂极性增大，荧光效率减小。
由此可见，荧光峰的位臵和强度与溶剂的关系，规 律性不强，必须具体分子具体分析。
菲绕啉在联二苯中不同温度时的荧光光谱
荧 光 强 度
较高的温度 下，热运动 加快，溶质 分子与溶剂 分子之间的 碰撞机会增 大，荧光效 率下降。
定
4 磷光光谱法
激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，发生
导致荧光减弱，称为内滤（自吸是一种内滤）
2-苯胺-6-萘磺酸的荧光发射光谱 A 乙腈 B 乙二醇 C 30%乙醇-水 D 水
8－羟基喹啉在不同溶剂中的荧光表现
溶剂 介电常数 荧光峰/nm 荧光效率
四氯化碳 氯仿 丙酮 乙腈
2.24 5.2 21.5 38.8
390 398 405 410
0.002 0.041 0.055 0.064
与浓度的线性关系将出现偏离。
单组分直接测定
单组分间接测定
化学反应转化为荧光分子
荧光猝灭法 多组分的荧光测定 荧光峰不重叠，选不同的发射波长；激发光谱 明显不同，荧光峰重叠，可选用不同的激发波长
无机物分析：无机阳离子本身不发荧光，可与一些有
机试剂形成荧光配合物，可以测定的元素已达60多种
荧光光谱的特征 斯托克斯（Stokes）位移： 在溶液中，荧光发射波长总
是比其相应的吸收（激发）光谱的波长长，该现象是1852年
由Stokes发现，因此称为Stokes位移。这种位移反映了荧光 激发与发射间产生的能量损失（来源于振动驰豫和溶剂的分 子的驰豫作用）。
镜像对称规则：吸收光谱形状表明了第一激发态的振动能
磷光 4
对于大多数有机物分子，其电子数为偶数，净自 旋之和为S＝0，即基态分子为单重态（M＝ 2S+1=1）。 分子处于激发态时，某个电子可能会改变自旋方 向，即自旋平行，此时S＝1/2+1/2=1，分子处于这样 的激发态为三重态，以T表示。由于自旋平行比自旋 配对的状态更稳定，因此三重态能级比单重态略低。 根据光谱选律，分子直接被激发到三重态T1 的概 率比较小，因为是S0－T1禁阻跃迁。
磷光的寿命比荧光长得多，约为10-3s~10s。
由于分子结构和所处环境不同，各去激发过
程的速率不同。如荧光发射过程较其它过程快，
则可观察到荧光现象。
荧光的量子效率 发荧光的分子数与总的激发态分子数之比
发射的光子数 吸收的光子数

K f Ki
Kf
Kf荧光发射过程速率常数，主要取决于分子结构；
对于很稀的溶液，即bc 0.05，此时上面的式
子中第二项以后的各项可以忽略不计，即 1－e-2.303bc＝ 2.303bc If＝ Ia＝ I0 2.303bc 因此，当激发光强度一定，并且溶液浓度较小时， 荧光强度与荧光物质浓度之间成正比： If ＝Kc
对于较浓的溶液，其吸光度大于0.05时，荧光强度
溶液单分子行为研究：罗丹明6G标记DNA 基因研究与检测：DNA与小分子的相互作用等 生物化学和生理医学： 能测定微量氨基酸和蛋白质，
还能研究蛋白质的结构，酶以及酶动力学和机理，细胞新 陈代谢等
药物分析：分析低浓度的药物，6－巯基嘌呤是急性白
血病的重要药剂，相关分析方法还较少。用高锰酸钾将6－ 巯基嘌呤氧化形成嘌呤－6－磺酸盐，即可用荧光法进行测
拉曼散射光－和瑞利散射有关的另一种形式的散射光。它
是由分子吸收了频率较低的光上升到基态中较高的振动能级 后，返回到稍高于或稍低于原来的能级时发射的光，其波长
较激发光波长稍长或者稍短。一般说来，拉曼散射光比瑞利 散射光弱。
荧 硫酸奎宁水溶液 光 强 在320nm光激发 度 下荧光光谱中的 各类型散射峰
跃迁类型：*→量子效率高，因为跃迁摩尔吸光系数 大100-1000倍，跃迁寿命短（10-7~10-9s），n→*（107~10-9s），其次，系间跨越速率常数小
共轭效应：稠环化合物一般发强荧光 取 代 基 效 应 ： 给 电 子 基 团 （ -NH2, -OH, -OCH3, -
450
360 320
320nm是一级瑞利散射光， 640nm是二级瑞利散射光， 450nm为荧光峰，360nm 为水的一级拉曼光，720nm 为水的二级拉曼光。
640
720
（nm） 除了荧光峰之外，都会在空白试验中出现。因此，当荧光物 质的荧光峰与激发光波长靠近甚至重叠时，散射光会严重影 响方法的灵敏度，应设法减小或消除此影响。在测定前，先 测空白溶液的发射光谱，然后选择合适的激发波长。溶剂的 散射光随激发波长变化而变化，而荧光峰与激发波长无关， 这样通过改变激发波长即可消除散射的影响。
分子发光光谱法
基本要求： 1. 理解分子荧光和分子磷光的基本原理 2. 理解分子荧光激发光谱、发射光谱、同步光谱
和三维荧光光谱的含义
3. 掌握分子荧光发射光谱的特性
4. 了解荧光光谱仪的组成和各部分作用
5. 掌握荧光分析法和磷光分析法的主要应用范围
ห้องสมุดไป่ตู้
6. 了解化学发光分析法的原理和应用
分子发光光谱法包括： 光致发光
级结构，荧光光谱形状取决于基态中各振动能级的分布情况。 一般基态中振动能级与第一激发态振动能级分布是类似的，
因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。
苝的苯溶液的荧光光谱和吸收光谱
荧光光谱的特征 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关：
荧光物质发射荧光的特性之一是不管引起物质分子激发
的波长是1还是2，荧光的波长都是3。
② 固定能量同步扫描荧光法：= (1/ex -1/em)不变
③ 可变波长同步扫描荧光法：两个单色器以不同的速率扫描
特点：光谱简化，谱带窄化，减小光谱重叠，减小 散射光的影响，选择性提高，但损失其他光谱带含 有的信息
并四苯的激 发光谱和发 射光谱（a）
同步荧光光 谱 =3nm （b）
分子的去激发过程
速率最快，激发态寿命最短的途径占优势。
振动驰豫－受激溶质分子向溶剂分子转移过剩
的能量，以10-13s~10-11s的极快速度
荧光发射－以10-9s~10-7s左右的短时间内发射光
量子回到基态的各振动能级
内部转换－激发能转化为热能。其速度取决于
此过程所包含的两个能态之间的相对能量差。 当两个电子能级非常靠近，以至其振动能级有 重叠时，内部转换十分容易发生。如两个单重 激发态或两个三重激发态的较低激发态的高振
这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激 发态的分子经振动驰豫即内转换等过程最终回到第一激发态
的最低振动能级上，而分子荧光的发射总是从该能级跃迁到 基态的各振动能级上，因此其形状与激发波长无关。
反映在光谱图上就是具有一个吸收带和两个吸收带的不 同物质，一般都发射一个荧光谱带（个别例外）。
影响荧光强度的因素 分子结构
三维荧光光谱－20世纪80年代发展起来，以荧光强 度为激发波长和发射波长的函数得到的光谱图，也 称为总发光光谱，等高线光谱等。 ① 三维曲线光谱图
② 平面显示的等强度线光谱图
特点：提高完整的光谱信息，可作为光谱指纹技术
用于环境检测和法庭试样的判证。
（a）蒽和萘的三维荧光光谱图 （b）8-羟基苯芘的等强度光谱图
-168º C -150º C
-78º C
24º C

NH3+
NH2
NH-
pH < 2 无荧光
7-12 蓝色荧光
pH > 13 无荧光
金属离子与有机试剂形成的荧光配合物，受pH 的影响更大。一方面影响配合物的稳定性，一方面
影响配合物的组成。
例如，镓离子与邻二羟基偶氮苯在pH3－4溶液中形成1：
1配合物，发荧光。在pH6－7溶液中则形成1：2配合物，不 发荧光（ 1：2 型平面结构不存在） 。
∑Ki 系间跨越、外转换等其他无辐射跃迁的速率常
数的总和，主要取决于环境。
荧光激发光谱和发射光谱
荧光激发光谱－固定发射波长，扫描激发波长得到
的荧光强度－激发波长的关系曲线，反映了在某一
固定发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对 效率。激发光谱用于进行荧光测定时选择恰当的激 发波长。 荧光发射光谱－固定激发波长，扫描发射波长得到
动能级常常与较高激发态的低振动能级重叠，
重叠的地方两激发态能量一致，内部转换效率 很高，速率很快，一般只需要10-13s~10-11s的时 间。
外转换－激发态分子与溶剂和其它溶质分子之
间的相互作用即能量转换过程。它是荧光和磷 光的竞争过程，因此该过程使发光强度减弱甚 至消失，这种现象称为“淬灭”或“熄灭”。 体系间跨越跃迁－受激分子从激发单重态转至
灵敏度高，检测下限低0.1~0.001g/cm3 ，荧光分
析法的应用广泛，可测定60余种元素，尤其是生物