缀合物的水解 酸水解(盐酸) 溶解剂法 (硝酸-高氯酸消化)
酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)
有机破坏 (硝酸-高氯酸消化)
分离、纯化 与浓集
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液-液萃取法 (Liquid-Liquid Extraction,LLE)
液-固萃取法 (Liquid-Solid Extraction,LSE)
汁、泪液、脑脊液、胆汁等。
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（一）样品的采集
1．血样 血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反
映靶器官的浓度。
血细胞
血液
抗凝 自然
血浆（plasma） 血小板 血清（serum） 血细胞
全血 测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓
2．尿样
目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度 特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分 离 优点：易得，属非损伤性取样，样品量大；尿中药物浓度高，
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（三）生物样品去蛋白处理
目的： 去除蛋白质可使结合型的药物释放出来，
以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预 防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成， 以及可以保护仪器性能，延长使用期限
1．加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl
另一种是挥去提取溶剂后，再用少量适 合的溶剂溶解后测定。
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衡量提取方法优劣的一个重要指标就 是提取回收率，它是指药物从生物样品中 被分离出来用于测定的比例，一般应高于 60%
----乙酸乙酯、叔丁基甲基醚可用于80% 药物的萃取
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文献上常提到的LLE的缺点
传统萃取方式回收率低、样品用 量大、繁琐费时、溶剂用量大、溶剂 毒性大、易乳化、不能自动化操作
1．酸水解 ： 0.1mol/L HCl，100℃，30min， 条件较 剧烈，易致药物分解，空白值也高。 2．酶水解：葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，也可用二者 的混和物。一般在pH4.5-7，37℃数小时，条件温和， 选择性强，但费用较高。
3．溶剂解：缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入 的溶剂在萃取过程中被分解。
优点：①与杂质分离②简便 ③浓集 ④提取率高
采用LLE要考虑的几个问题
（1）溶剂的选择与纯度要求 纯度AR以上
①了解药物与溶剂的化学结构与性质，按相似相 溶原则选用②对药物的未电离分子可溶，而对电 离形式的分子不溶（光谱分析法）③沸点低、易 挥发、浓集④与水不相混溶⑤无毒，不易燃烧⑥ 不易形成乳化（氯仿易乳化，毒性大）⑦具有较 高的化学稳定性和惰性⑧不影响紫外测定
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（二）样品的贮藏
1．血样（血浆、血清）及时分离→冷藏， -70℃加入 稳定 剂NaF 2．尿样 ①尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长， 4℃保存 ②加入防腐剂 a．1%甲苯 b．饱和氯仿 c．pH改变 3．唾液：同血样
第二节 生物样品的预处理与制备
30%以上工作和费用用在样品前处理上 18
二、生物样品的预处理
How for GC?
硅烷化
酰化
烷基化
不对称化
why?
某些药物或者代谢产物极性大，挥 发性低，或者对检测器不够灵敏， 难以满足常规HPLC及GC检测的 需要，因此进行衍生
How for LC?
UV
FL 非对映衍 生化
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（五）分离、纯化与浓集
（2）药物因素
a．剂型因素（生物利用度问题） b．药物合并使用（酶抑、酶促） c．环境因素（环境污染、食品、个人精神状态）
分析目标
药物特有 代谢产物
药物在体内的某 些代谢产物常具 有一定的生理活 性,它们在体内 的变化规律对母 体药物的药理学 与毒理学评价特 别重要.
母药
体内内源性 生物活性物 质
活化——甲醇润湿小柱，活化填料，除去杂质并创造一 定的溶剂环境。
平衡——水或适当缓冲液冲洗小柱。 上样——将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分
保留在柱上。弃去废液
淋洗——水或缓冲液最大程度除去干扰物。 洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
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亲水型填料
用作SPE的亲水型填料有硅藻土、硅胶、棉 纤维等，其原理为分配作用。填料为支持物，水 基质中极性强的成分与填料结合牢固，流动相为 与水不相混溶的有机溶剂，较亲脂的药物易分布 于流动相，从而达到萃取的目的。
（五）超滤分离法
是以多孔半透膜（超滤膜）作为分 离介质的一种膜分离技术，选用不 同的孔径的不对称膜，即可按照分 子量大小进行分离
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Therapeutic drug
monitoring
适合TDM 血样分析
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（六）化学衍生法
why?
某些药物或者代谢产物极性大，挥 发性低，或者对检测器不够灵敏， 难以满足常规HPLC及GC检测的 需要，因此进行衍生
监测；唾液样品也可用于药代动力学研究。
优点：不受时间和地点的限制，可反复采集，采集时无痛苦、 无感染危险；唾液成分比血液、尿液简单，提取方便，有时 可直接上样测定；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离 型药物浓度。
缺点： 唾液是各腺体分泌的的混合液体，其 组成发生经时变动。 S/P只有少数药物是恒定值。 蛋白结合率较高的药物，药物在唾液 中的浓度低。 对有些患者（昏迷）不能采集唾液样 品。
亲水型填料SPE有较高的萃取回收率（大于 80%），但洗脱剂用量较大（一般大于5ml）， 无浓集作用，萃取液较干净。
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SPE优点：1、不发生乳化；2、适应的极性范 围较广；3、提取效率高；4、方便快速； 5、溶剂用量少；6、易于自动化；7、室 温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不 稳定的药物。
目前，商品化固相提取小柱 （cartridge）的应用已比较普遍。
毒性大的尽量不用
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（2）有机溶剂相和水相的体积比 1∶1或2∶1 由实际情况决定，文献中有的10∶1以上
（3）水相的PH值 主要由药物的pKa决定！
生物样品一般多在碱性下提取！
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由于血药浓度较低，提取时需浓集
传统的浓集方法主要有两种：一种是在 末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组 分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量 供测定。
其中100mg为填料的质量，1ml是空柱管的体积。
c.一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通 常是一次性使用的。
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SPE填料
亲脂型:大孔吸附树脂，亲脂性键合硅胶。 亲水型：硅胶、硅藻土。 离子交换：苯磺酸基，羧基等。
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亲脂性键合相硅胶SPE柱的实验步骤：
固相萃取操作一般有五步：
最大的缺点： 贵 20多元/支
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三种方法的优缺点比较
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第三节 体内药物分析方法的建立与评价
一、分析方法
灵敏度
专属性
色谱法
+++
+++
HPLC GC
免疫法
++++
++
免疫交叉反应，重现性
生物学方法
+
+
特异性较差，需与色谱法平行使用
根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验
目的
二、分析方法的设计依据
372.固相萃取(So来自id Phase Extraction，简称SPE)法
关于固相萃取小柱：
a.常见的固相萃取柱分为三部分： 医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛 板(20μm)和填料(多为40-60μm， 80-100μm)。
b.常用规格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml 等。以100mg/1ml为例：
含有缀合物或代谢物，是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含 量极低，不需去蛋白处理。 缺点： 与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功 能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已 知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。
3．唾液
唾液是无损伤性采样，易采集。
一些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓 (P)密切相关，因此，在TDM中可利用测定S代替P
①从代谢产物中开发新药(保泰松和羟基保泰松) ②前药设计 ③新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等 以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决
（二）临床合理用药中的意义
1．血药浓度与药理作用 思考题:剂量增加, 药效是否成正比增加???
2. 影响血药浓度的因素
（1）机体因素
a．生理因素: 年龄、性别、生理状况（妊娠期） b．病理因素（胃肠道、肝脏、肾脏） c．遗传因素（乙酰基转移酶代谢异烟肼、乙醇脱氢酶）
方法的建立
原始方法改进→创新 创立方法
1．做好文献总结
FID
GC ECD N/P-FID
GC-MS
常用体内样品预处理方法
去除蛋白 质方法
分离与富 集方法
缀合物 水解
萃取
化学衍 生化
微透析 技术
如何进行？
常用体内样品预处理方法
加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)
蛋白质 的去除
加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐) 加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸) 加入金属沉淀剂(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)
机体内源性生物 活性物质往往参 与机体重要的生 理过程,其变化 规律的异常改变 也与某些疾病的 发病机制密切相 关
三、体内药物分析的对象
动物
人
鼠 兔 犬 猴猩 猩
男
女
大鼠