引物设计首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2. 碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。

不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

非配对结构最好出现在引物中间。

另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。

5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。

Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。

6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。

引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8. 对引物的修饰一般是在5’端。

引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

9.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

10.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。

否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

11. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP 对扩增的成功是有帮助的。

引物合成1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

第一步，将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

它不能有效去除比目的片段短的小片段。

实际上，它是一种脱盐的作用。

这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。

对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

◆OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。

OPC法纯化的DNA纯度大于95%。

适用于40mer以下引物的纯化。

◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。

◆HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。

纯度可以大于99%。

主要用于短链和修饰引物的纯化。

该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。

3.引物的OD数如何定量？引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。

测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。

DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。

需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4.定量不准是怎么回事儿？（1）生产人员定量错误。

（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。

（3）系统误差，10%左右为允许误差。

引物工作浓度范围很宽，少许偏差不影响实验。

（4）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。

验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。

5.需要什么级别的引物？引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。

根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增< 45base OPC>45 base PAGE诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGEDNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成）根据实验要求定PAGE反义核酸根据实验要求定PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC6.最长可以合成多长的引物？引物越长，出现问题的概率就越大。

我们合成过120base的引物，但是产率很低。

除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。

7.需要合成多少OD数？根据实验目的确定。

一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。

如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。

但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。

做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。

片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。

超出需要之外的OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。

8.如何检测引物的纯度？实验室方便的作法是用PAGE方法。

使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。

取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。

600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。

9.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。

引物一般配制成10-50pmol/ul。

溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD 数是否一致。

一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。

引物的分子量可以从合成报告单上获得。

如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.10.如何计算引物的Tm值？引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。

11.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。