2、替换型载体（取代型载体）

（一）插入式载体
• λ噬菌体载体相对于质粒载体来插入失活
•如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及
Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的
失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶源化，产生 清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。

基 因 red 和 gam 位 于 非 必 需 区 域 内 ， 外 源 DNA片段能置换基因red和gam形成重组体， 其重组体不能在recA-的P2溶源菌中繁殖
可以在recA＋ 的P2溶源菌中繁殖并且显示出 Spi-的表型。因此只要选用recA+的P2溶源菌 作为宿主菌，就可以对重组体进行筛选。
阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌
体转录。

需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染
色体上删除下来，使之形成环形的DNA分
子，恢复溶源周期开始时的状态。
Hif
整合酶必须首先与宿主编码的宿主整合因子(host integration factor，Hif)结合形 成复合体，才能催化 attP和 attB在O区进行重组而形成原噬菌体。
cI
LA 32.7
λgt 10
EcoR I
RA10.6
λgt 10
•
Lac Z基因插入失活：如charon16A，λgt 11载 体，在非必需区段引入lac Z基因，在lac Z基 因上有EcoRⅠ位点，插入失活后利用X-gal法 筛选（兰白筛选）。
lac Z
LA 19.9
EcoR I
RA21.9

如 果 这 个 具 有 supE 基 因 的 EcoRⅠ 片 段 被 外 源
DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在
上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。
• 替换型载体克隆外源DNA的步骤
1、应用适当的核酸内切酶消化λ载体，除去可 取代的DNA片段； 2、将上述所得的 λDNA载体臂同外源DNA片 段的连接； 3、对重组体的λDNA分子进行包装和增殖， 以得到有感染性的λ重组噬菌体
第五章 噬菌体载体和 柯斯载体
本章主要内容
噬菌体一般特性 λ噬菌体 柯斯质粒 M13噬菌体 1、M13噬菌体特性及基因组结构 2、M13噬菌体载体类型及特点 噬菌粒

比较
第一节 噬菌体的一般生物学特性
（Bacteriophage，phage）
• 噬菌体可以在脱离寄主 细胞的状态下保持生命， 但一旦脱离了寄主细胞， 就不能生长和复制 • 利用寄主的核糖体、蛋 白质合成因子、氨基酸 和产能体系，进行生长 和繁殖
λ 取代载体
2、组装 1. 连接
3、侵染
（三）凯伦噬菌体载体
• 在λ噬菌体基础上发展起来的 • 承受外源DNA的能力：几个kb到23kb
（左右臂连接）
（三段自身连接）
（插入片段）
三、 λ噬菌体载体的改良
改良的目标：

扩大克隆容量 设计可对重组体分子作正选择的克隆载体 构建可以方便的通过转录作用制备外源 DNA插入序列之RNA探针的克隆载体 发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖 苷酶形成融合蛋白的克隆载体
•λ 噬 菌 体 分 子 量 31×106dal，中等大 小的温和噬菌体，目 前已经定位61个基因， 其中一半参与了生命 周期，为必要基因； 余下的为非必要基因。
溶菌阶段
(复制和释放)
溶源阶段
(整合寄主染色体)
一、λ噬菌体的分子生物学概述
1、基因组结构
λ phage
（1）cos位点
• 线性双链DNA分子两端各有一条12nt组成的
菌周期，称为溶源性诱发。
① 超敏感免疫性

阻遏－操纵体系：cⅠ基因编码阻遏蛋白，启 动子PL和PR，操纵基因OL和OR
cⅠ PL OL
OR
PR
• 阻遏蛋白同操纵基因结合使RNA聚合酶不能起 始转录，这种状态有充分的能力使原噬菌体保 持“关闭”形式，溶源细菌能够正常生长。
② 溶源噬菌体的诱发

依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。

recA＋的P2溶源菌
red gam 导入
red gam P2 λ +
λ
无噬菌斑
外源DNA 取代 导入 λ
-
P2
滚环复制

λDNA 的 复 制 是 由 θ 型 向 滚 环 型 的 转 变 ， 受 到 gam基因控制 基因gam功能：蛋白产物和寄主细胞的外切核酸 酶Ⅴ（宿主recB和recC基因产物）结合成复合物， 失去对λDNA的作用活性，因而λ噬菌体能够合 成成熟的多联体DNA，供作包装底物
四、噬菌体的溶源生命周期

溶源生长周期：是指在感染过程中没有产 生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一 个组成部分。 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源 周期

1、概念

温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进
入溶源生命周期。

溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组 的细菌 溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之 形成溶源性细菌的过程
• Charon 4A载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系 列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同 时将Lac 5作为选择标记 •使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆 片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在 E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑 Charon 4A Lac 5
att：提供整合酶的识别位点
③ 控制基因 • cIII、N、cI、cro、cII ④ 溶菌基因——S、R
Protein coat
DNA
λ phage
Long (left) arm short (right) arm
cos
12bp
Nonessential region
cos
Exogenous DNA (~20-23 kb)


整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞 染色体DNA中 原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或 非整合的噬菌体 超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一 次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。


2、溶源周期的主要特征


λ噬菌体和P1噬菌体
λ噬菌体的特征：
(1) 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞
(2) 经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于 是转录活性便被一种阻遏物所关闭 (3) 噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA 上，变成原噬菌体
charon16A
（二）λ 替换型载体（取代型载体）
eg: EMBL3, DASH
• 外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的 感染和复制非必要的片段 (~ 20 kb) • 高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA，比质 粒高100-倍) • 替换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
• Charon 4A载体
短片段 重复替换区
LA 19.2
MCS
MCS
RA 9.6
•λNM781

在λNM781替换型载体中，可取代的EcoRⅠ片段， 编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基
因），这种λNM781噬菌体感染细胞后，寄主细
胞lacZ基因的琥珀突变被抑制，因此能在X-gal琼
脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。
(4) 细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染 色体的一部分进行复制。

噬菌体P1基本特征：
不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而
是变成了一种进行独立复制的环形的质粒
DNA分子。
3、超感染免疫性
（1）溶源细菌的两个重要特点：

不能被头一次感染的噬菌体再次感染，称为
超感染免疫性；

经过许多世代以后，溶源性细菌可以进入溶
EcoR I
• λEMBL 3/ 4、Charon40
• Charon 40的中间可取代区段是一种DNA短片段 多次重复而成，称为多节段区，两个短片段之间可 被NaeⅠ识别，因此用它做载体可以有效的将其中 的多节段区清除，从而得到的多是重组的噬菌体。 克隆能力达到9～22kb Charon 40
彼此完全互补的5’突出单链
• 注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成 为cos位点。
cos位点的两个作用：

使进入细菌的DNA 分子成为环状 ，这 是插入细菌基因组 的先决条件。
作为识别位点，由 内切酶将滚环复制 的多联体DNA切开

The phage cos ends
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’ Circular form
一、 噬菌体的结构和其核酸类型 结构：无尾部结构的二十面体型、
具尾部结构的二十面体型、
线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、 双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。

不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是
比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较
复杂；对寄主的依赖性较低
Cleavage Ligation (during packaging)
(after infection)
GGGCGGGCGACCTCG-3’ 5’-CG + GC-5’ 3’-GCCCCGCCGCTGGA Linear form
（2）基因组
右侧区 N右侧
左侧区 A～J
中间区 J～N
λ噬菌体的基因组结构
二、λ噬菌体载体的主要类型
1、插入式载体

一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的 派生载体。只能插入较小分子量的外源（＜ 10kb），广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆 具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 可以克隆较大分子量的外源，克隆高等真核生物 DNA