5、 质粒的类型
•根据分子特性，革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种
接合型 又叫自主转移的质粒 具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套 控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
可以在不同细胞间转移。
非接合型的质粒 不能自我转移的质粒，失去控制细菌配对和质粒接合 转移的基因。 不能自主转移。
F质粒的tra区包含细菌接合所需的基因
基因克隆载体系统
•质粒载体
•噬菌体载体
•柯斯质粒载体
•单链噬菌体载体
染色体载体
•其它特殊用途载体
一、基因工程四大要素：
目的基因
工具酶
克隆载体 受体系统
二、为什么要用克隆载体？
• 单独的基因不易进入细胞 • 进入后不能维持. 三、什么是克隆载体？
vector 通过不同途径能将承载的外源DNA片段带 入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分 子称为DNA克隆载体或基因克隆载体。
•常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。 这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具 有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生 抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及 降解复杂的有机化合物等。
质粒通过合成长 效致死物和短效 解毒剂得以在细 菌中生存.
2.质粒的生物学特征
只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。 自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的 线粒体中都发现有质粒的存在。
质粒绝大多数是环形双链的DNA
但也存在有线形质粒 、RNA质粒（酵母的杀伤质粒） 质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有 一些质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随 染色体的复制而复制,称为附加体。
3.环形双链DNA质粒分子组成与构型 多数为双链环状DNA分子. 分子量从不足2kb 到100kb以上,多数为10kb左右.
质粒的转移与迁移.
转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞. 迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下,从一个细 胞移至另一种细胞.
质粒迁移的条件（自身编码） ①bom位点(col E1) nic 位点. ②mob基因.结合动员基因.编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶, 切割nic位点.
在基因工程中得到大量的应用.
重 组 质 粒
受 体 细 胞
接 合
供 体 细 胞
辅 助 质 粒 D N A 转 移
三亲杂交法
•根据质粒的性状特征，可分为五种不同的类型：
F(Fertility)质粒: Ｒ(Resistance)质粒 Col质粒 降解质粒（Degradative plasmids） 致瘤质粒（Virulence plasmids）农杆菌Ti质粒
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。
因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另 一种细胞,这种方法叫三亲杂交法.
一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌 三者共培养过夜.
具有三种不同的构型：
共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的 环形结构。DNA呈超螺旋的SC构型。 开环DNA(ocDNA)：有一条保持完整的环形结构，另一条链 出现有一至数个缺口。即OC构型。 线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺 旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
根据质粒的转移功能分类
按接合转移功能分 类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因 自主复制基因，抗菌素抗性基因
按抗性记号分类
Col质粒 R质粒(R因子)
接合型质粒
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区 F质粒（ F因子） 段 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基 Col质粒 因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基 R质粒(R因子) 因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基 Ent质粒 因
1. 质粒的特点： •已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围 较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。 •是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 •已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝 并将质粒分子精确地分配给子代细胞。
•其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。
4.必须是安全的。
五、克隆载体的种类
根据来源可分为：
质粒载体
病毒或噬菌体载体 质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体 质粒DNA与染色体DNA片段组成的克隆载体等
根据用途可分为： 表达克隆载体 启动子探针型载体 cDNA克隆载体等
根据应用对象可分为： 原核生物克隆载体、植物克隆载体和动物克隆载体等。
载体具有如下功能:
1.运送外源基因高效转入受体细胞
2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
四、作为克隆载体的DNA分子必须具备主要条件：
1.有1至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。 2.能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而 同步复制。 3.必须具有用于选择克隆子的标记基因。
根据其复制或存在 方式可分为:
自主复制型载体和
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第四章 基因克隆的质粒载体
一、与构建克隆载体相关的质粒性质
质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制 的遗传成份. Plasmid一词由Joshua Lederberg于1952年提出。
质粒的命名:
例:pBR322 p代表质粒; “BR”代表两位研究者 Bolivar和Rogigerus 姓氏的字首,“322”是实验编号 .
正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反
4. 作为克隆载体质粒的条件
适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括 三种共同的组分： 复制子 选择性标记基因 克隆位点 基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数