项目三：青霉素的生产
一、实验相关知识
1、青霉素又被称为青霉素G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、
青霉素钾、苄青霉素钾。
青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。
青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称,由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁,而人类只有细胞膜无细胞壁,故对人类的毒性较小,除能引起严重的过敏反应外,在一般用量下,其毒性不甚明显,但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶,易被其破坏,且其抗菌谱较窄,主要对革兰氏阳性菌有效。
青霉素G有钾盐、钠盐之分,钾盐不仅不能直接静注,静脉滴注时,也要仔细计算钾离子量,以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能,造成死亡。
2、1929年英国学者弗莱明首先在抗生素中发现了青霉素，英国谢菲尔德大学病
理学家弗洛里实现对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，与英国生物化学家钱恩共获1945年诺贝尔奖。
青霉素分为天然的和半合成的，天然的青霉素是通过菌种发酵得到的。
3、理化性质：
（1）溶解度：青霉素本身是一种游离酸，易溶于有机溶剂，但在水溶液中溶解度很小。
（2）吸湿性：青霉素的吸湿性与其内在质量有关；纯度越高，吸湿性越小，也就易于存放。
（3）稳定性：青霉素的水溶液是一种不稳定的化合物，而晶体状态比较稳定。
（4）酸碱性：青霉素的分子结构中有一个酸性基团（羧基），无碱性基团。
4、常见的化学反应：
（1）青霉素的碱性水解
（2）青霉素的酸性水解（完全水解和不完全水解）
（3）青霉素的裂解
5、青霉素应用的注意事项：
①应用青霉素前应做皮试
②青霉素不可与同类抗生素联用，不可与磺胺和四环素联合用药，
不可与氨基糖苷类混合输液。
③宜短期使用，切忌长期大量给药，以免血药浓度持续升高，导致
致敏物质的形成与堆积，造成过敏反应。
④通常静脉给药，宜慢不宜快，以每分钟不超过60滴的速度静脉滴
注，以免血药浓度增高过快而增加分解过敏可能。
⑤青霉素的副作用中，过敏性休克是致命的，常引起人们的注意，而表
现为脑病及周围神经损害的神经毒性作用易被忽略。
必须打消以往认为青霉素只要不过敏，就很少有中毒的观念，千万不要大剂量滥用青霉素（包括其它抗生素），必须用时，尽量少用静脉输注，老年人、小儿尤应慎用；此外，还须注意，青霉素与氨苄青霉素合用时，更易引起青霉素脑病的发生。
二、生产原理
（1）青霉素是产黄青霉菌株在一定的培养条件下发酵产生的。
生产上一般将孢子悬液接入种子罐经二级扩大培养后，移入发酵罐进行发酵，所制的的含有一定
浓度青霉素的发酵液经适当的预处理，再经提炼、精制、成品分包装等工序最终制得合乎药典要求的成品。
（2）青霉素的生物合成受碳源、氮源、终产物、分支途径调控，所以必须人为创造适宜的环境来培养微生物。
培养基是用人工方法配置的各种营养物质比例适宜、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。
适宜的培养基是从事微生物研究和发酵生产的重要基础。
（3）灭菌：分干热灭菌和湿热灭菌。
干热灭菌（烘箱160-170℃,2h）;湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅121℃,30min）。
灭菌后的物品随用随打开包装纸。
三、实验材料
（1）菌种：青霉菌菌种
（2）培养基：
LB培养基配方：牛肉膏1g 蛋白胨2g Nacl1g 琼脂3g 葡糖糖4g 配成200ml
液体培养基配方：可溶性淀粉9g、蛋白胨1.2g 、玉米浆2ml、葡萄糖3g、K2HPO40.15g 、MgSO4·7H2O 0.15g、NaCl0.15g、蒸馏水300ml。
发酵培养基配方：花生饼粉（高温）、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，CaCO3等。
四、实验步骤
1、接种：将灭好菌的LB培养基放入超净台内，将LB培养基倒入无菌试管内，试管摆斜面冷却凝固。
等培养基凝固后，用接种环接取菌种，并在培养基上画S 形曲线接种
2、菌种活化：待接种好的菌吸附在培养基上,置于25℃恒温箱中培养5天。
3、扩大培养：
（1）液体试管培养：将液体培养基倒入试管内，用接种环自斜面试管挑取一环斜面种子菌体，接入试管中。
摇匀后，置培养箱培养。
待培养成熟后，再接入三角瓶培养。
（2）三角瓶液体培养：将液体培养基倒入三角瓶内，用接种环自液体培养的试管挑取种子菌体，接入三角瓶（可接2-3次）。
摇匀后，置摇床培养。
4、青霉素发酵：从三角瓶中接种到发酵罐中，接种量为12-15%。
青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制0.7-1.8；150－200r/min；要求高功率搅拌，100 m3的发酵罐搅拌功率在200-300 Kw，罐压控制0.04-0.05 MPa，于25-26 ℃下培养，发酵周期在200h左右。
前60h，pH5.7-6.3，后6.3-6.6；前60h 为26℃，以后24℃。
5、青霉菌发酵产物初步分离：
（1）预处理及过滤：发酵液放罐后需冷却至10℃后，经鼓式真空过滤机过滤。
从鼓式真空过滤机得到青霉素滤液pH在 6.2~7.2，蛋白质含量一般在0.05%~0.2%。
这些蛋白质的存在对后面提取有很大影响，必须加以除去。
除去蛋白质通常采用10%硫酸调节pH4.5~5.0，加入0.05%（质量浓度）左右的絮凝剂的方法，同时再加入0.7%硅藻土作助滤剂，再通过板框过滤机过滤。
经过第二次过滤的滤液一般澄清透明，可进行萃取。
（2）提取：结合青霉素在各种pH下额稳定性，一般从发酵液中萃取到醋酸丁酯时，pH选择在1.8~2.2范围内，而从丁酯相反萃取到水相时，pH选择在6.8~7.4范围内对提取有利。
生产上一般将发酵滤液酸化至pH等于2.0，加1/3体积的醋酸丁酯（简称BA）混合后以卧式离心机（POD）机分离的一次BA萃取液，然
后以NAHCO3在pH6.8~7.4条件下将青霉素从BA中萃取到缓冲液中，再用10%H2SO4调节pH等于2.0，将青霉素从缓冲液中再次转入BA中（方法同前面所述），得二次BA萃取液。
（3）脱色：在二次BA萃取液中加入活性炭150~350g/10亿单位，进行脱色，过滤。
6、青霉菌发酵液效价初步测定
牛津杯法，通过测定抑菌圈大小估算效价
（1）制作金黄色葡萄球菌平板
（2）采用牛津杯法加入青霉菌标准液和提取液。
（3）按金黄色葡萄球菌培养要求对平板进行培养。
（4）培养结束后测平板上抑菌圈大小。
（5）以标准品为对照，估算效价。
五、注意事项
1、发酵培养基成分的控制:
a.碳源--生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液进行流加；
b.氮源--常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源；
c.前体--可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前体对青霉素的毒害；
d.无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等，用量要适度。
2、发酵中灭菌
青霉素属于β-内酰胺类抗生素，其β-内酰胺环极易破坏而失效，所以不可以高压灭菌了，否则将导致完全失效。
3、发酵液质量控制
生产上按规定时间从发酵罐中取样, 用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。
生产上惯称“镜检”,根据“镜检”中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度, 通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间, 以获得最多青霉素。
当菌丝中空泡扩大、增多及延伸, 并出现个别自溶细胞, 这表示菌丝趋向衰老, 青霉素分泌逐渐停止, 菌丝形态上即将进入自溶期, 在此时期由于茵丝自溶, 游离氨释放, pH 值上升, 导致青霉素产量下降, 使色素、溶解和胶状杂质增多, 并使发酵液变蒙古稠, 增加下一步提纯时过滤的困难。
因此, 生产上根据“镜检”判断, 在自溶期即将来临之际, 迅速停止发酵, 立刻放罐, 将发酵液迅速送往提炼工段。