猪病诊断技术规一、致病性大肠杆菌的检测1 引用标准参考NY/T 555-2002（动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法）。

2 围适用于猪大肠杆菌病的诊断。

3 检测方法3.1 材料3.1.1 营养肉汤3.1.2 营养琼脂3.1.3 EMB3.1.4 TSI3.1.5 IMViC生化鉴定管3.1.6 小白鼠3.2 分离培养a)将采集的肝、脾、心血或肠容物等分别接种伊红美兰琼脂平板（同时接种营养肉汤增菌备用），置37 ℃培养18~24 h。

b)观察培养特性，挑取黑色有金属光泽的菌落，用该菌落涂片，革兰氏染色，镜检。

c)如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌，应取5~10个典型菌落再接种于TSI琼脂。

d)同时挑取典型菌落接种营养琼脂，37 ℃培养16~18 h的菌液用于生化特性鉴定。

3.3 生化鉴定挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管，(36±1) ℃培养24 h 后观察结果。

3.3.1 靛基质试验：a)滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1 mL于靛基质试验培养基中混合，观察结果。

b)出现红色环的为反应阳性；出现黄色环的为反应阴性。

3.3.2 甲基红（MR）试验a)滴加甲基红指示剂0.2 mL于MR-VP培养基中混合，观察结果。

b)出现红色为阳性反应；出现黄色为阴性反应。

3.3.3VP试验a)滴加VP试剂甲液0.2 mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1 mL混匀，静置，观察结果。

b)在15 min出现红色的为阳性反应；无颜色变化的为阴性反应。

阴性结果1 h后再观察一次，出现红色也为阳性反应。

3.3.4 枸橼酸盐试验：观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应；不变色为阴性反应。

3.4 大肠杆菌鉴定结果应符合表1要求。

表1 大肠杆菌鉴定结果出现表1的生化反应类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌。

如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验。

3.4 致病性试验a)取经营养肉汤37 ℃培养16~18 h后的纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重20g左右的小白鼠，每株接种2~3只，每只0.3 mL（含菌量约为1×1012 cfu／mL），同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。

b)饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。

在24小时出现死亡的可报告为致病性大肠杆菌。

4 药敏试验a)挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，37 ℃培养16~18 h，菌液用于药敏试验。

b)将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1×109 cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5，置37 ℃培养24 ｈ后观察。

c)根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。

二、沙门氏菌的检测1 引用标准参考NY/T 550-2002（动物和动物产品沙门氏菌检测方法）。

2 围适用于猪沙门氏菌病的诊断。

3 检测方法3.1 材料3.1.1 SC3.1.2 DHL3.1.3 TSI3.1.4 赖氨酸脱羧酶（LD）3.1.5 邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（DNPG）3.1.6 甘露醇糖发酵管3.2分离培养a)采集疑似病例的肝、脾、心血或肠容物样品。

b)无菌剪取肝、脾样品1 g，投入10 mL SC增菌液中（血液、粪便样品可以采适量直接投入10 mL增菌液），36±1 ℃培养18~24 h。

c)取一接种环增菌液划线接种于DHL琼脂平板上，36±1 ℃培养18~24 h。

观察平板上菌落生长形态。

沙门氏菌在DHL平板上呈无色半透明，产硫化氢（H2S），菌落中心黑色或几乎全黑色。

3.3 生化鉴定a)挑取DHL平板上可疑菌落3~5个，每个菌落先洗入TSI培养基冷凝水中，继而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。

b)再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱羧酶发酵试验（LD）和ONPG，甘露醇糖发酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困难，可用接种环醮取TSI培养基中冷凝水接种其余生化管，36±1 ℃培养18~24 h（挑取菌落后的平板，应置于4 ℃冰箱保留48 h以备复查）。

c)按表1记录反应结果，对照表2进行判定。

d)凡符合表2生化反应模式，可报告为沙门氏菌。

表1 生化反应结果判定表2 生化检测沙门氏菌属判定表4 药敏试验a)挑选DHL平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，36±1 ℃培养16~18 h，菌液用于药敏试验。

b)将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1×109cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5，置36±1 ℃培养24 ｈ后观察。

c)根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。

三、产气荚膜梭菌的检测1 引用标准自定标准。

2 围适用于猪产气荚膜梭菌病的诊断。

3 材料3.1 绵羊血琼脂3.2 牛乳培养基。

4 组织染色镜检对疑似病例的肠道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直杆状，两端钝圆，单在或成双，无鞭毛，不运动。

芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，多数菌株可形成荚膜。

5 分离培养可将肠道容物接种血平板，37 ℃厌氧培养18～24 h后观察。

菌落特点：魏氏梭菌在血平板上可形成直径2～5 mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状菌落，有双层溶血环。

可通过镜检对形态进一步确定。

6 生化鉴定对牛乳培养基的“暴烈发酵”。

7 肠毒素检查采集空肠后段或结肠前段容物，加适量生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份加热（60 ℃30min）。

两份上清液分别静脉注射家兔（1～3ml）或小鼠（0.1～0.3ml）。

如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时死亡，而加热组动物不死亡。

8 报告因为正常人畜肠道存在此菌，并且发病菌主要靠在肠道产生毒素致病，细菌本身并不侵入机体。

因此只有细菌分离和肠毒素检查都符合，并结合临床症状才能报告产气荚膜梭菌感染。

鉴别A型和C型要靠中和保护试验。

四、猪痢疾诊断1 引用标准参考NY/T 545-2002。

2 围适用于猪痢疾（SD）的实验室诊断。

3 粪便中Sh显微镜检查3.1 材料3.1.1 器材：显微镜，暗视野镜头，玻片及盖玻片，酒精灯等3.1.2 染色液：结晶紫染色液或稀释的石炭酸复红。

3.1.3 样品：病猪新鲜粪便（含粘）或直肠拭子或大肠容物及黏膜3.2 操作方法3.2.1 染色样品制作：取样品直接抹片，干燥，火焰固定，以1.2.2结晶紫液或稀释复红染色2 min~3 min，水洗，吸干后待检。

3.2.3 悬滴样品制作：取样品少许悬于生理盐水，待检。

每份样品最少制片23.2.4 显微镜检查：染色样品以油镜直接观察，悬滴样品在暗视野400~1000倍镜头下观察。

3.3 结果判定典型Sh菌体长6 μm~8.5 μm，呈2~5个密螺旋体，两端尖锐，呈蛇样活泼运动。

当视野中有数量（3~5条以上）Sh样菌体时，在获培养前，可作为诊断的重要参考。

4 分离培养和鉴定4.1 材料准备4.1.1 器材：厌氧培养装置及使用方法，细菌学实验常规器材，外科手术器材，微孔滤器和0.65 μm滤膜。

4.1.2 试验动物：小鼠（20 g左右）4.1.3 试剂：PBS(0.01M，pH7.2)，生理盐水，多粘菌素，TSA。

4.1.4 样品：病猪新鲜粪便或大肠粘膜刮取物（含粘液）。

对死猪或扑杀猪大肠分段结扎（每段10cm），分离取出。

样品应尽早分离培养，也可0～4 ℃保存4～7 d。

4.2 操作方法4.2.1 样品种Sh镜检将样品少许摸片染色或作成悬滴标本，镜检，观察Sh有无活力。

含菌量少且无活力者，则难以分离成功。

4.2.2 分离培养4.2.2.1 直接划线分离法：即取样品直接在TSA上划线接种若干皿。

4.2.2.2 集菌法：先将样品以生理盐水或PBS作1：5稀释，2000 r/min，弃去沉淀。

将上清液再以6000～8000 r/min离心20 min。

取沉淀划线接种TSA若干皿。

4.2.2.3 稀释法：将样品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀释至10-6～10-8。

取各梯度稀释液各1滴，分别划线接种于TSA上，（每梯度稀释液最少接种3皿）。

接种后的培养皿置厌氧罐进行厌氧培养。

若上述稀释液中加入多粘菌素200 U/mL～300 U/mL，可提高分离率。

4.3 结果判定4.3.1 观察每隔2～4 d开罐检查一次，共2～4次，观察有无溶血区及溶血菌落。

致病性Sh呈强β溶血，一般看不见菌落。

当培养条件适宜时，再溶血区可见到云雾状菌苔。

无害蛇样螺旋体等呈弱β溶血。

4.3.2 移植纯化先作溶血区物质涂片，染色镜检。

如见Sh样菌体，可在无菌落溶血区移取小块琼脂划线于TSA若干皿。

如此每隔2天移植一次，一般2~4次后即可纯化和保存。

4.3.3猪蛇样螺旋体鉴定4.3.3.1 溶血试验将猪蛇样螺旋体、无害蛇样螺旋体或毛肠蛇样螺旋体及被检菌株，分别划线于同一TSA上不同区，经48 h培养后，观察比较其溶血程度。

4.3.3.2 肠致病性试验每菌株至少接种6只小鼠，将小鼠停饲24 h后，每只每次灌服1 mL（含菌3～5亿），次日再灌服一次，15 d后剖检观察盲肠病变。

感染后50％出现腹泻和病变者，则为致病性Sh。

五、猪巴氏杆菌病诊断技术1 引用标准参考NY/T 564-2002。

2 围适用于猪巴氏杆菌病的检测。

3 材料3.1 改良马丁氏琼脂3.2 马丁氏肉汤3.3 常用生化培养基。

4 组织染色镜检用肝脏组织或心血摸片或纯培养物染色呈阴性，瑞氏染色呈两极浓染的球杆菌。

5 病原分离鉴定将濒死前或死后数小时以无菌手术采取病死猪的心血、肝脏组织，接种于改良马丁氏琼脂斜面，进行分离。

培养18～24 h后，改良马丁琼脂斜面生长纯粹的培养物，呈微蓝色菌台或菌落。

马丁肉汤培养物生长为均匀浑浊，不产生菌膜。

6 生化鉴定本菌发酵葡萄糖、果糖、半乳糖，多数发酵蔗糖，不发酵乳糖、肌醇、菊糖、水素及鼠糖，吲哚试验和氧化酶试验阳性。

7 诊断判定根据临床症状和病理变化，加上涂片染色镜检，可对本病作出初步的诊断，但确诊要靠病原分离鉴定。

六、猪链球菌病诊断技术1 引用标准参考GB/T 199 15.2-2005和GB/T 199 15.9-20052 围适用于猪链球菌病诊断。

3 材料3.1 绵羊血琼脂4 组织染色镜检对最急性和急性病例，无菌采取集病死猪的心、肝、脾、肺、肾和淋巴结等组织做触片，姬姆萨染色，链球菌可见较纯的单个或成双的圆形或椭圆形球菌, 有少量形成短链和长链，如见链球菌则表明病料中可能含有链球菌。

5 病原分离鉴定无菌取心、肝、脾、肺、肾或淋巴结部组织划线接种普通琼脂绵羊血平板，36±1℃培养24±2 h，如果菌落生长缓慢，可延长至48±2 h后观察。