抗肿瘤肝微粒体代谢种属比较研究报告目录1研究目的 (3)2 材料与方法 (3)2.1药品 (3)2.2样品及预处理方法 (3)2.3仪器和条件 (3)2.4数据分析 (4)3 结果 (4)3.1抗肿瘤对照品溶液的UPLC-UV/Q-TOF MS分析 (4)3.2UPLC-UV/Q-TOF MS法鉴定肝微粒体孵育液中的抗肿瘤相关代谢产物 (4)3.2.1 M0（[M+H]+，m/z 809.265） (5)3.2.2 M1（[M+H]+，m/z 212.101） (5)3.2.3 M2（[M+H]+，m/z 364.129） (5)3.2.4 M3（[M+H]+，m/z 380.125） (5)3.2.5 M4（[M+H]+，m/z 464.147） (6)3.2.6 M5（[M+H]+，m/z 480.142） (6)3.2.7 M6（[M+H]+，m/z 709.210） (6)3.2.8 M7（[M+H]+，m/z 825.259） (6)4 结论 (7)附图 (8)附表 (23)1研究目的本研究比较抗肿瘤在人、猴、犬、大鼠和小鼠五个种属肝微粒体中代谢过程的差异，为临床前药动学和安全性评价研究动物种属的选择提供参考。

2 材料与方法2.1 药品抗肿瘤储备液由美迪西普亚医药科技（上海）有限公司提供。

2.2 样品及预处理方法肝微粒体样品由美迪西普亚医药科技（上海）有限公司提供。

取肝微粒体双样本样品各60 μL合并，获得人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体的0 min和60 min样品。

加入360 μL乙腈沉淀蛋白，离心10 min（4000 rpm）。

全取上清液于40 o C空气下吹干，残留物用120 μL乙腈/水（1:9, v/v）溶解，涡流混合。

取 2.0 μL进行UPLC-UV/Q-TOF MS分析。

2.3仪器和条件仪器美国Waters公司Synapt G2-Si型四极杆-飞行时间串联质谱仪（Q-TOF MS），配有电喷雾电离源（ESI源）和Acquity UPLC H-CLASS液相色谱系统。

色谱条件色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18 column（2.1 ×100 mm I.D.，1.7 µm粒径），美国Waters公司；柱温为45ºC；流速为0.4 mL/min；紫外检测波长200 –600 nm，流动相梯度见下表。

质谱条件离子源为电喷雾电离源（ESI），正离子扫描方式检测，去溶剂气（氮气）流速为750 L/h，去溶剂气温度为350 o C，源温度为120 o C，毛细管电压为3.0 kV。

低能量扫描时传输碰撞能量为2 eV，阱碰撞能量为2 eV；高能量扫描时传输碰撞能量为12 –18 eV，阱碰撞能量为18 –32 eV。

扫描范围为m/z 50 –1200。

选取400 ng/mL的亮氨酸-脑啡肽（m/z 556.2771）作为质荷比校正外标物，流速为6 µL/min。

2.4 数据分析采用Waters公司的Masslynx V4.1软件进行数据采集，采用Waters公司的Masslynx V4.1中的子软件MetaboLynx XS进行数据分析。

3 结果3.1 抗肿瘤对照品溶液的UPLC-UV/Q-TOF MS分析首先对抗肿瘤对照品溶液进行UPLC-UV/Q-TOF MS分析，推测质谱裂解规律，为其他代谢产物结构推测奠定基础。

在本研究选取的色谱条件下，抗肿瘤的色谱保留时间为7.74 min（图1A和1B），一级全扫描质谱图中（图1C），获得m/z 809.265的准分子离子（[M + H]+）。

在高碰撞能量下，产生m/z 112.048、272.046、387.069、524.093、661.117和735.192的碎片离子。

为了便于描述，将抗肿瘤结构中的两个羧酸酯键分别命名为酯键A和酯键B。

推测的抗肿瘤的质谱裂解途径如图2所示。

本试验将根据这些质谱断裂特点，鉴定抗肿瘤在肝微粒体中的代谢产物（图3和4）。

代谢物按照分子量和保留时间依次命名。

3.2 UPLC-UV/Q-TOF MS法鉴定肝微粒体孵育液中的抗肿瘤相关代谢产物与孵育0 min的肝微粒体比较，在孵育60 min肝微粒体样品中主要发现8种相关离子，其质荷比分别为m/z 809.265、212.101、364.129、380.125、464.147、480.142、709.210和825.259，分别命名为M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7。

其中M3检测到两个色谱峰，根据保留时间分别命名为M3-1和M3-2；M7检测到三个色谱峰，根据保留时间分别命名为M7-1、M7-2和M7-3。

在人肝微粒体孵育体系中检测到所有代谢物M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7（图3A）。

在猴肝微粒体孵育体系中检测到M1、M2、M3-1、M4、M5和M7-2（图3B）。

在犬肝微粒体孵育体系中检测到M0、M1、M2、M3-1、M4、M5、M6和M7-2（图3C）。

在大鼠肝微粒体孵育体系中检测到代谢物M1、M2、M3-1和M4（图3D）。

在小鼠肝微粒体孵育体系中检测到代谢产物M1、M2、M3-1、M4和M5（图3E）。

这些离子的精确质量信息以及可能元素组成见表1。

为了确定这些相关离子对应的结构，对这些离子进行产物离子全扫描质谱分析。

3.2.1 M0（[M+H]+，m/z 809.265）在人和犬肝微粒体中能检测到M0，以人肝微粒体样品为例对M0的鉴定加以说明。

从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 809.265，在保留时间t R为7.75 min 出现一个色谱峰（图5-1），命名为M0。

M0与抗肿瘤对照品溶液的色谱保留时间以及质谱行为相同，确定M0是未被代谢的原形药物抗肿瘤。

3.2.2 M1（[M+H]+，m/z 212.101）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到M1，以人肝微粒体样品为例对M1的鉴定加以说明。

从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z212.101，在保留时间t R为5.37 min出现一个色谱峰（图5-2），命名为M1。

根据精确质量，推测M1的分子式为C9H13N3O3，比原形减少C23H27N3O11F4。

在高碰撞能量下，M1产生与原形相同的碎片离子m/z112.051。

碎片离子m/z156.041为末端丁基断裂后产生，因而推测M1为原形N-去烷基化的代谢产物。

3.2.3 M2（[M+H]+，m/z 364.129）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到M2，以人肝微粒体样品为例对M2的鉴定加以说明。

从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z364.129，在保留时间t R为5.86 min出现一个色谱峰（图5-3），命名为M2。

根据精确质量，推测M2的分子式为C14H19F2N3O6，比原形减少C18H21N3O8F2。

在高碰撞能量下，M2产生与原形相同的碎片离子m/z112.051。

碎片离子m/z308.069为末端丁基断裂后产生。

因而推测M2为原形酯键A水解的代谢产物。

3.2.4 M3（[M+H]+，m/z 380.125）从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z380.125，在保留时间t R为4.38和4.62 min各出现一个色谱峰（图5-4），分别命名为M3-1和M3-2。

在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中能检测到M3-1，而M3-2仅在人肝微粒中检测到。

以人肝微粒体样品为例对M3的鉴定加以说明。

根据精确质量，推测M3的分子式为C14H19F2N3O7，比原形减少C18H21N3O7F2。

在高碰撞能量下，M3-1和M3-2产生相似的碎片离子。

碎片离子m/z 156.041和308.069与M2的碎片离子相同。

碎片离子m/z 228.098比M2的碎片离子m/z 212.104增加了16 Da，因而推测M3为M2羟基化的代谢物。

3.2.5 M4（[M+H]+，m/z 464.147）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到M4。

从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 464.147，在保留时间t R为6.37 min出现一个色谱峰（图5-5），命名为M4。

根据精确质量，推测M4的分子式为C18H23F2N3O9，比原形减少C14H17N3O5F2。

在高碰撞能量下，M4产生原形相同的碎片离子m/z112.051。

碎片离子m/z 156.041和212.103与M2的碎片离子相同。

因而推测M4为原形酯键B水解的代谢产物。

3.2.6 M5（[M+H]+，m/z 480.142）在人、猴、犬和小鼠肝微粒体中均能检测到M5。

以人肝微粒体样品为例对M5的鉴定加以说明。

从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z480.142，在保留时间t R 为4.99 min出现一个色谱峰（图5-6），命名为M5。

根据精确质量，推测M5的分子式为C18H23F2N3O10，比原形减少C14H17N3O4F2。

在高碰撞能量下，M5产生与原形相同的碎片离子m/z272.046。

碎片离子m/z 390.075比M4的碎片离子m/z364.096增加了16 Da。

因而推测M5为M4羟基化的代谢产物。

3.2.7 M6（[M+H]+，m/z 709.210）仅在人和犬肝微粒中能检测到M6。

以人肝微粒体样品为例对M6的鉴定加以说明。

从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 709.210，在保留时间t R为6.00 min 出现一个色谱峰（图5-7），分别命名为M6。

根据精确质量，推测M6的分子式为C27H32F4N6O12，比原形减少C5H8O2。

在高碰撞能量下，M6产生与原形相同的碎片离子m/z 112.050、272.048、387.071和524.093，因而推测M6为原形酰胺水解的代谢产物。

3.2.8 M7（[M+H]+，m/z 825.259）从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 825.259，在保留时间t R为6.63、6.69和6.88 min各出现一个色谱峰（图5-8），分别命名为M7-1、M7-2和M7-3。

M7-1和M7-3仅在人肝微粒中能检测到，而M7-2可在人、猴和犬肝微粒中被检测到。

根据精确质量，推测M7的分子式为C32H40F4N6O15，比原形增加一个O。

在高碰撞能量下，M7-1~M7-3生成相似的二级图谱，均产生与原形相同的碎片离子m/z 272.047、387.081、524.095、661.118和735.189。

碎片离子m/z 751.176比原形的碎片离子m/z 735.189增加16 Da，因而推测M7-1~M7-3均为原形羟基化的代谢产物。

4 结论抗肿瘤在人肝微粒体中孵化60 min后，仅检测到少量原形药物，共检测到10种代谢产物。